D. Yu. Rjazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fütopatogeenne seen Colletotrichum coccodes põhjustab kartulites ja tomatites antraknoosi ja mugula musta laiguna tuntud ohtlikke haigusi. Morfoloogiliste tunnuste järgi on neid sageli raske eristada teiste mikroorganismide põhjustatud haigustest; rohelise tomati viljadel võib haigus olla asümptomaatiline, avaldudes ainult küpsetel punastel viljadel. Patogeeni kiireks ja täpseks diagnoosimiseks pakutakse reaalajas PCR-testi süsteemi. Testimissüsteemi väljatöötamiseks määrati Venemaa erinevates piirkondades kartulimugulatest eraldatud tüvede 45 C. glütserooltrifosfaatdehüdrogenaasi geeni nukleotiidjärjestus.
Saadud tulemuste ja GenBanki andmebaasis leiduvate teiste liikide sarnaste järjestuste analüüsi põhjal kavandati C. coccodes'i liigispetsiifilised praimerid ja sond. Loodud testisüsteemi spetsiifilisuse kontrollimiseks viidi PCR läbi DNA-ga, mis oli eraldatud 15 erineva tomati- ja kartulitaimega seotud parasiitsete ja saprotroofsete seente (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes) puhtast kultuurist. Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNA olemasolu määrati künnistsüklis 20–27, teised liigid avastati pärast 40 tsüklit või neid ei tuvastatud. Katsesüsteem võimaldab usaldusväärselt tuvastada C. coccodes DNA kontsentratsiooni üle 0.01 ng / mm3 analüüsitud PCR segus. Väljatöötatud testisüsteemi abil uuriti C. coccodes esinemist seenhaiguste sümptomitega tomatilehtedes ja ilma väliste haigusnähtudeta kartulimugulates. Seennakkuse sümptomitega lehed koguti Krasnodari oblasti kahelt erinevalt põllult, mugulatelt - Kostroma, Moskva, Kaluga, Nižni Novgorodi oblasti põldudelt. Üks C. coccodes DNA-d sisaldav tomatileht leiti Krasnodari territooriumilt; selle patogeeni DNA märkimisväärne esinemine tuvastati Kostroma, Moskva, Kaluga piirkondades kasvatatud mugulate 5 proovis.
Sissejuhatus
Perekonna Colletotrichum seened on ohtlikud fütopatogeenid, mis mõjutavad teravilja, köögivilju, ürte, mitmeaastaseid puuvilja- ja marjataimi. Selle perekonna üks üldlevinud liike Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes on kartulite ja tomatite antraknoosi ning musta laigu põhjustaja ja põhjustab paljude teiste Solanaceae sugukonna taimede, sh. umbrohud (Dillard, 1992). C. coccodes mõjutab taime kõiki maa-aluseid osi, varre aluseid, lehti ja vilju (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Nakatunud kartulimugulate koorel täheldatakse ebaselgelt väljendunud servadega hallide laikude arengut, millel on selgelt nähtavad mustad sporulatsiooni- ja mikrosklerootiad. Säilitamise ajal võivad mugulate viljalihas tekkida pehmenenud sisuga haavandid, s.t. haigus läheb antraknoosi faasi, mis on siiski äärmiselt haruldane.
Samal ajal on antraknoosi (väikeste mustade täppidega nahahaavandid) sümptomid tomativiljadele tüüpilised. Lehtedel ilmnevad C. coccodes sümptomid tumepruunide laikudena, mida tavaliselt piiravad kollased koed (Johnson, 1994).
Mustade laikude tekkimine mugulatel rikub nende välimust, mis on eriti väljendunud pestud punakoore kartulite müümisel. Koori koorimine viib liigse aurustumiseni ja suurenenud ladustamiskadudeni (Hunger, McIntyre, 1979). Teiste taimeorganite kahjustamine toob kaasa saagikadu, mida täheldati nii avatud kui ka suletud pinnasel (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). C. coccodes põhjustatud haigused on levinud peaaegu kõigis kartulit tootvates piirkondades maailmas, sealhulgas Venemaal (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Nende haiguste tõrje on keeruline, kuna olemasolevad fungitsiidid on ebapiisavalt tõhusad C. coccodes'e vastu ja resistentsete sortide puudumine (Read, Hide, 1995).
C. coccodes inoculum võib püsida seemnemugulates (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), tomatiseemnetes (Ben-Daniel et al., 2010), püsida pikka aega mullas, taimeprügil (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) ja umbrohus (Raid, Pennypacker, 1987). Mitmete autorite tööd (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson jt, 1997; Dillard, Cobb, 1993) on näidanud, et haiguse areng kartulites ja tomatites sõltub suuresti inokulaadi olemasolust seemnetes ja muld. Seetõttu on haigusest tulenevate kahjude minimeerimiseks vaja diagnoosida (sh kvantitatiivsed) seene levikud seemnematerjalis, mullas, seemnekartulimugulates ja ladustamiseks pandud tomatiseemnetes. Morfoloogilist diagnostikat mullas ja taimses materjalis saab läbi viia ainult mikrosklerootiate olemasolu korral, mida leidub aga ka teist tüüpi seentes.
Mugulate sümptomid on väga sarnased seene Helminthosporium solani põhjustatud hõbekoorega. Colletotrichum coccodes ja Helminthosporium solani eraldamine puhtaks kultuuriks on üsna keeruline ja aeglane kasvu tõttu toitainekeskkonnas võtab see kaua aega. Colletotrichumi kokkoodide kiireks tuvastamiseks on vaja kasutada instrumentaalseid diagnostikameetodeid. Kõige mugavam meetod on polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) ja selle modifitseerimine - reaalajas PCR. Praegu kasutatakse Euroopas ja Ameerika Ühendriikides Briti teadlaste (Cullen et al., 2002) rDNA piirkonna ITS1 jaoks välja töötatud testisüsteemi. Selle kasutamine on näidanud häid tulemusi Venemaa isolaatide analüüsimisel (Belov et al, 2018). Kuid C. coccodes on väga varieeruv ja selle tuvastamine ühest DNA järjestusest võib viia valenegatiivsete tulemusteni. Usaldusväärsema diagnoosi saamiseks on vaja analüüsida mitut liigispetsiifilist DNA järjestust ja seetõttu oleme välja töötanud originaalse testimissüsteemi, mis võimaldab C. coccodes identifitseerida glütseraldehüüd-3-fosfaatdehüdrogenaasi geeni järjestuse järgi.
materjalid ja meetodid
Loodud testisüsteemide efektiivsuse ja spetsiifilisuse hindamiseks kasutasime 15 seeneliigi puhtaid kultuure, mille autorid eraldasid mõjutatud tomati lehtede ja puuviljade, kartulimugulate proovidest (tabel 1). Eraldamiseks võtsime seeninfektsiooni sümptomitega taimede elundid, mitte rohkem kui ühe elundi põõsa kohta.
Koorega mugula viil, tomativilja viil ja kahjustatud leht asetati binokulaarse mikroskoobi alla, mille järel kanti seeneniidistik, eosed või koetükk teritatud dissekteerimisnõelaga Petri tassis agari söötmele (virre-agar). Isolaate hoiti katseklaasides 4 ° C juures kaldus agaril.
Seenehaiguste sümptomitega tomatilehtede proovid, mis olid ette nähtud analüüsimiseks kohe pärast kogumist (põllul), pandi 70% etüülalkoholi, milles neid hoiti kuni DNA eraldamiseni. Kartulimugulad toimetati laborisse, kooriti neist (2 × 1 cm tükk) ja külmutati temperatuuril –20 ° С. Säilitatakse külmutatuna kuni DNA eraldamiseni.
DNA eraldamiseks mõeldud puhtaid seenekultuure kasvatati vedelas hernesöötmes. Seeneniidistik eemaldati vedelast keskkonnast, kuivatati filtripaberil, külmutati vedelas lämmastikus, homogeniseeriti, inkubeeriti CTAB puhvris, puhastati kloroformiga, sadestati isopropanooli ja 0.5 M kaaliumatsetaadi seguga, pesti kaks korda 2% alkoholiga. Saadud DNA lahustati deioniseeritud vees ja säilitati temperatuuril –70 ° C (Kutuzova et al., 20). DNA kontsentratsiooni mõõtmiseks kasutati Qubit 2017 (Qiagen, Saksamaa) kaheahelalise DNA HS-kvantifitseerimiskomplekti. Alkoholiseeritud ja külmutatud proovid tritureeriti vedelas lämmastikus, seejärel viidi läbi DNA ekstraheerimine, nagu eespool kirjeldatud (puhaste seenekultuuride seeneniidistiku jaoks).
Tabel 1. Kasutatud seenetüvede päritolu
Seene nimi | Taim, orel | Valiku koht |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | kartulimugul | Kostroma piirkond, 1. põllupõlve kartulimugulad, sort Red Scarlett |
Colletotrichum cocccodes 4 | kartulileht | Esindaja Mari El, Joškar-Ola |
Helminthosporium solani | kartulimugul | Magadani piirkond, pos. Telk, kartulimugul |
Cladosporium fulvum | tomatileht | Moskva piirkond, suureviljaline tomat |
Alternaria tomatophila | tomatipuu | esitasid ülevenemaalise taimekaitse uurimisinstituudi mükoloogia ja fütopatoloogia labori töötajad |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomatipuu | Krasnodari territoorium, Krõmski rajoon, kreem |
Fusarium oxysporum | nisujuur | Moskva piirkond |
PCR viidi läbi DTprime võimendil (DNA-Technology). PCR-i jaoks kasutati glütserooltrifosfaatdehüdrogenaasi geeni liigispetsiifilise piirkonna algupäraseid praimereid ja sondi: edasine praimer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, pöördkrunt Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Praimerid võimendavad 213 aluspaari piirkonda.
Reaktsiooniks kulus 50 ng kogu DNA-d (lehtede ja mugulate analüüsimisel) ja 10 ng (puhaste seenekultuuride DNA analüüsimisel). Reaktsioonisegu (35 μl) eraldati parafiinikihiga kaheks osaks: alumine (20 μl) sisaldas 2 μl 10x reaktsioonipuhvrit (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM igast deoksünukleotiidtrifosfaadist, 7 pmol igast praimerist ja 4 pmol hüdrolüüsitavat fluorestseerivat sondi; ülemine sisaldas 1 μl 10x PCR puhvrit ja 1 U Taq polümeraasi.
Segu eraldamine parafiiniga võimaldab torusid pikka aega säilitada temperatuuril 5 ° C ja pärast PCR-reaktsiooni kuumtöötlust pärast nende 10-minutist kuumutamist temperatuuril üle 80 ° C. PCR viidi läbi järgmise programmi kohaselt: 94.0 ° C - 90 s (1 tsükkel); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 tsüklit); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 tsüklit); 10.0 ° C - ladustamine.
Tulemused ja arutlus
Glütserooltrifosfaatdehüdrogenaasi geeni järjestused määrati 45 tüvest, mis eraldati Venemaa erinevates piirkondades lehtedest, vartest, kartulimugulatest ja tomativiljadest (Kutuzova, 2018). Kõigi tüvede uuritud järjestused jagati kahte rühma, mis erinevad kahe nukleotiidi poolest. Mõlema rühma esindajate nukleotiidjärjestused numbritega KY2 ja KY496634 on hoiul GenBankis.
Nende põhjal kavandatud praimereid coc70gdf, coc280gdr ja cocgdz-sondi kontrolliti programmi BLAST abil (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) kõigi perekonna Colletotrichum ja teiste GenBanki andmebaasis leiduvate organismide glütserooltrifosfaatdehüdrogenaasi geeni järjestuste kohta.
Ühtegi teiste praimeritele ja sondile homoloogsete organismide DNA piirkondi ei leitud.
Katsesüsteemi tundlikkust kontrolliti proovide abil, milles oli erinev kontsentratsioon C. coccodes DNA, antraknoosiga nakatatud kartulilehe DNA (kogutud 2017. aastal Mari El, sort Red Scarlett) ja mustast laikust mõjutatud mugulate koor (kogutud Kostroma piirkonnas sort Red Scarlett, tabel 2). DNA olemasolu kinnitamiseks mugulates ja kartulilehtedes eraldati C. coccodes tüved neist puhtatesse kultuuridesse.
Testisüsteemi tundlikkusanalüüsi tulemused näitavad, et seda saab edukalt diagnoosida C. coccodes DNA olemasolu proovis, kui selle kogusisaldus PCR segus on üle 0.05 ng. See on avastamiseks täiesti piisav, kuna üks sklerootia sisaldab keskmiselt 0.131 ng ja üks spoor sisaldab umbes 0.04 ng DNA-d (Cullen et al., 2002). Inglise rühma (Cullen et al., 2002) välja töötatud testisüsteem näitas sarnast tundlikkust (künnistsükkel 34 0.05 ng DNA juures ja 37 0.005 ng juures).
C. coccodes sisaldavate looduslike proovide analüüs võimaldas kõigil juhtudel usaldusväärselt paljastada selle olemasolu proovis (tabel 2). Kavandatud DNA eraldamise meetod oli rakendatav ka looduslike taimeproovide analüüsimisel.
Tabel 2. Kavandatud testisüsteemi tundlikkuse määramine Colletotrichumi kokkoodide tuvastamiseks reaalajas PCR jaoks
Näidis | DNA kogus proovis *, ng | Künnistsükkel | C. kokkoodide tuvastamine |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Mugulakoor 1 | 50 | 32 | + |
Mugulakoor 2 | 50 | 30 | + |
Mugulakoor 3 | 50 | 31.5 | + |
Kartulileht | 50 | 29.5 | + |
Märge. * PCR-toodete segus.
Katsesüsteemi spetsiifilisust kontrolliti 15 seeneliigist ekstraheeritud DNA proovidega. Autorid eraldasid kõik seenetüved kahjustatud ja tervislikest tomati viljadest ja lehtedest, kartulimugulatest; üks tüvi eraldati nisujuurtest (tabel 1). Puuvilja pinnalt isoleeritud liikide hulgas on ka liike, mis pole tomatile patogeensed (näiteks Phellinus ferrugineovelutinus).
Uuringud on näidanud, et C. coccodes DNA tuvastati künnisperioodil 20–27, samas kui teisi seeneliike ei tuvastatud või nad andsid pärast 40. tsüklit signaali, mille võib seostada mittespetsiifilise müraefektiga (tabel 3).
Tabel 3. Erinevat tüüpi seente testimissüsteemi kontrollimine
Seene nimi | Künnistsükkel |
Colletotrichum cocccodes 1 | 20.9 |
C. koktsid 2 | 22.6 |
C. koktsid 3 | 23 |
C. koktsid 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Märge. * DNA kogus kõigis proovides 10 ng.
Väljatöötatud testisüsteemi kasutati C. coccodes tuvastamiseks nekrotroofsete patogeenide ja seemnekartulimugulate sümptomitega tomatilehtede proovides ilma nähtavate sümptomiteta. Uuringu jaoks võtsime erinevate sortide seemnemugulad, mida kasvatati Kostroma, Moskva, Kaluga, Nižni Novgorodi oblastis. C. coccodes DNA olemasolu peeti proovides oluliseks, mille analüüsimisel ei ületanud lävitsükkel 35. See läviväärtus valiti usaldusväärse 0.05 ng C. coccodes DNA määramise põhjal (lävitsükkel 33.5, tabel 2) ja asjaolul, et üle 40-aastaste künnistsüklite korral diagnoositi mõne muu seeneliigi mittespetsiifiline DNA. Selle lähenemisviisi abil tuvastati C. coccodes DNA märkimisväärne esinemine Kostroma, Moskva, Kaluga piirkondades kasvatatud mugulate 5 proovis ja ühes Krasnodari piirkonna Yeiski rajooni tomatilehes (tabelid 4, 5).
Tabel 4. Colletotrichumi kokkoodide tuvastamine kartulimugulatel *
Proovi number | Kartuli sorteerimine | Kasvu koht | C. kokkoodide tuvastamine | Künnistsükkel |
---|---|---|---|---|
1 | Punane Scarlet | Kostroma piirkond | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva piirkond | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovski varakult | Moskva piirkond | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga piirkond | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantaasia | Kaluga piirkond | - | |
15 | Gala | Nižni Novgorodi piirkonnas. | - | |
16 | - |
Märge. * DNA kogus kõigis proovides 50 ng.
Tabel 5. Colletotrichumi kokkoodide tuvastamine tomatilehtedel *
Proovi number | Kasvu koht | C. kokkoodide tuvastamine | Künnistsükkel |
---|---|---|---|
1 | Krasnodari territoorium, Krimmi ringkond | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodari piirkond, Yeiski rajoon | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* DNA kogus kõigis proovides 50 ng.
Meie loodud testisüsteem ei jää tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest alla Briti teadlaste (Cullen et al., 2002) väljatöötatud süsteemile ning sobib taimeproovide analüüsiks. Selle kasutamine seemnemugulate analüüsimiseks võimaldas tuvastada mugulates esinevat C. coccodes DNA-d ilma väliste kahjustusnähtudeta ja edukalt analüüsida lehtede nakatumist.
Praeguseks ei ole Venemaal kartulimugulate C. coccodes nakatumise analüüsi tehtud. Meie esimene uuring näitas, et Vene Föderatsiooni erinevates piirkondades kasvatatud 16 testitud seemnemugulast 5 sisaldab C. coccodes. See näitab, et kartulimugulate must laik on Venemaal tavaline kartulihaigus ning selle rolli kartulisaagi mahu ja kvaliteedi vähendamisel on alahinnatud.
Tomatilehtede analüüs näitas C. coccodes DNA märkimisväärset esinemist ühes Krasnodari territooriumi Yeiski rajooni lehes. Varem, uurides Lõuna-Venemaal Briti testisüsteemi (Cullen et al., 2002) tomatipõlde, leiti C. coccodes sisaldavaid lehti ja mõnes valdkonnas leiti suur osa C. coccodes'ega nakatunud lehtedest (Belov et al. 2018). Moskva oblastis Krasnodari ja Primorski territooriumil leidsime tomativilju, millest õnnestus isoleerida puhtad C. coccodes kultuurid. Võimalik, et C. coccodes on Venemaal tomatil palju rohkem levinud kui praegu arvatakse, samuti alahinnatakse selle kahjulikkust.
Nii on tänaseks kogunenud piisavalt teavet C. coccodes'i laialdase leviku kohta kartulitel ja tomatitel.
Selle seene rolli paremaks mõistmiseks kartuli- ja tomatihaiguste tekkes on vajalik selle leviku ulatuslik jälgimine Venemaal, uurida mulla- ja seemnete nakatumise rolli ning musta laigu rolli ladustamisel tekkivates kadudes. PCR-diagnostika kasutamine võib seda tööd oluliselt hõlbustada ja mõlema testisüsteemi samaaegne kasutamine suurendab oluliselt analüüsi täpsust.
Seda tööd toetas Vene Teadusfondi toetus nr 18-76-00009.
Artikkel ilmus ajakirjas "Mükoloogia ja fütopatoloogia" (54. köide, nr 1, 2020).