S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Djakov
Sissejuhatus
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - hilispõletiku tekitaja, kartuli ja tomati majanduslikult kõige olulisem haigus - on rohkem kui poolteist sajandit äratanud erinevate riikide teadlaste tähelepanelikku tähelepanu. XNUMX. sajandi keskel Euroopas ootamatult ilmnenud põhjustas see kartuliepideemia, mis on jäänud paljude põlvkondade mällu.
Siiani nimetatakse seda sageli "Iiri nälja seeneks". Ligi sada aastat pärast esimesi epideemiaid avastati Mehhiko metsikud kartuliliigid, mis on resistentsed hilispõletiku suhtes, töötati välja meetodid nende ristamiseks kultiveeritud kartulitega (Muller, 1935) ja saadi esimesed hilispõletuskindlad sordid (Pushkarev, 1937). Varsti pärast nende kommertskasvatuse algust kogunesid resistentsete sortide suhtes virulentsed hilispõletiku patogeeni rassid. ja Mehhiko metsikartulist uute resistentsusgeenide juurutamine sortidesse hakkas kiiresti tõhusust kaotama.
Ebaõnnestumised monogeense (vertikaalse) resistentsuse kasutamisel sundisid kasvatajaid otsima keerukamaid viise mittespetsiifilise polügeense (horisontaalse) resistentsuse kasutamiseks. Viimastel aastatel on parasiidi üksikpopulatsioonides hakanud kogunema ülimalt agressiivsed rassid, mis põhjustavad isegi mittespetsiifilise resistentsuse erosiooni. Fungitsiidikindlate tüvede tulek on tekitanud probleeme kartulikaitsekemikaalide kasutamisel.
Oomütseetide ja seente keemilise koostise, ultrastruktuuri ja ainevahetuse oluliste erinevuste tõttu on fungitsiidid, eriti süsteemsed, mida kasutatakse taimede kaitsmiseks paljude seenhaiguste eest, oomütseetide vastu ebaefektiivsed.
Seetõttu kasutati hilise lõõmamise vastases keemilises kaitses mitmekordset (kuni 12 korda hooajal või rohkem) pihustamist laia toimespektriga kontaktpreparaatidega. Revolutsiooniline samm oli fenüülamiidide kasutamine, mis on oomütseetidele mürgised ja levivad taimedes süsteemselt. Kuid nende laialdane kasutamine viis kiiresti resistentsete tüvede kuhjumiseni seenepopulatsioonides (Davidse et al., 1981), mis komplitseeris taimekaitset oluliselt. P. infestans on praktiliselt ainus parasvöötme parasiit, mille kahjulikkust ei saa mahepõllunduses neutraliseerida ilma keemiliste kaitsevahendite kasutamiseta (Van Bruggen, 1995).
Eeltoodu selgitab eri riikide teadlaste tohutut tähelepanu P. infestansi populatsioonide uurimisele, nende arvukuse ja geneetilise koostise dünaamikale, samuti varieeruvuse geneetilistele mehhanismidele.
R. INFESTANSi elutsükkel
Oomycete Phytophthora infestans arendab kartulilehtede sees rakkudevahelist seeneniidistikku, millel on haustoria. Toitudes lehe kudedest, põhjustab see tumedate laikude moodustumist, mis muutuvad märja ilmaga mustaks ja mädanevad. Tugeva lüüasaamise korral sureb kogu leht. Pärast toitumisperioodi moodustuvad seeneniidistikul väljakasvud - sporangiofoorid -, mis kasvavad läbi stomaatide väljapoole. Märja ilmaga moodustavad nad lehtede alaküljel olevate laikude ümber valge õitsengu. Sporangiofooride otstes moodustuvad sidrunikujulised zoosporangiad, mis murduvad ja kannavad vihma pihustamist (joonis 1). Kartulilehe pinnal veetilkadesse sattudes idanevad eoslehed 6–8 zoosporiga, mis pärast liikumisperioodi on ümardatud, kaetud kestaga ja idanema idanemistoruga. Idand tungib lehtede koesse läbi stomata. Teatud tingimustel võivad eoslehekesed kasvustorus kasvada otse lehekoesse. Soodsates tingimustes on nakatumisest uue sporulatsiooni moodustumiseni aega vaid 3-4 päeva.
Sporangiumid on maapinnale sattunud ja läbi mulla filtreeritud mugulaid nakatama. Tugevalt mõjutatud mugulad mädanevad ladustamise ajal; nõrgalt mõjutatud nakkus võib püsida järgmise hooajani. Lisaks võib hilispõletiku tekitaja talvel püsida oosporide (paksuseinalised puhkavad seksuaalsed eosed) kujul mullas taimeprügil ja tomatiseemnetel. Oosporid moodustuvad taimede elusorganitel, kui erinevat tüüpi paaritumisega tüved kohtuvad liigniiskusega. Kevadel moodustub mittesuguline sporulatsioon istutatud nakatunud mugulatel ja oosporidega taimejääkidel; zoosporid satuvad mulda ja põhjustavad taimede alumiste lehtede nakatumist. Mõnel juhul võib seeneniidistik kasvada nakatunud mugulast mööda taime rohelist osa ja ilmuda tavaliselt varre ülemisse ossa.
Oluline erinevus oomütseetide ja enamiku seente vahel seisneb diplofaaside ülekaalus nende elutsüklis koos gameetilise meioosiga ja sigootide (oosporooside) idanemisega ilma reduktiivse tuuma lõhustumisena. See funktsioon koos biseksuaalsust asendava dipolaarse heterotallismiga näib võimaldavat oomütseetide suhtes rakendada kõrgemate eukarüootide populatsioonide uurimiseks välja töötatud lähenemisviise (panmixia ja populatsioonide alajaotuse analüüs, populatsioonisisesed ja rahvastevahelised geenivood jne). Kolm tegurit ei võimalda P. infestansi populatsioonide uurimisel neid lähenemisviise täielikult üle kanda.
1. Koos hübriid-oosporidega moodustuvad populatsioonides iseviljakad ja partenogeneetilised oosporid (Fife ja Shaw, 1992; Anikina jt, 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) ning nende moodustumise sagedus võib mõjutamiseks olla piisav testi tulemuste põhjal.
2. P. infestansi suguprotsess annab asurkonna suuruse dünaamikasse tähtsusetu panuse, sest seen paljuneb peamiselt vegetatiivsete eoste kaudu, moodustades toitainekeskkonnas traditsioonilise meetodi abil paaritumistüübi analüüsi tulemustest enam kui 90%. ... kasvuperiood on mitu sugulist sporulatsiooni põlvkonda (polütsüklilise haiguse areng). Oosporidel on oluline roll organismi säilimisel perioodil, kui rohelisi taimi pole (talvel), ja seemikute esmases nakatumises. Siis toimub suve jooksul klonaalne paljunemine ja seksuaalse rekombinatsiooni tulemusena tekkiv üksikute kloonide arvu suurenemine või vastupidi vähenemine, mille määrab peamiselt kohanenute valik. Seetõttu võib üksikute kloonide suhe populatsioonis epifütootikumide alguses ja lõpus olla täiesti erinev.
3. Kirjeldatud tsükkel on iseloomulik P. infestansi põliselanikkonnale nende kodumaal Kesk-Ameerikas. Teistes maailma piirkondades ei olnud seksuaalprotsess teada rohkem kui 100 aastat, nakatunud kartulimugulate vegetatiivne seeneniidistik oli talvitamise etapp. Elutsükkel oli täiesti agamaalne ja levik oli oma olemuselt keskne: nakatumine üksikutest nakatunud istutatud mugulatest kandus üle lehtedele, moodustades haiguse peamised kolded, mis võisid ühineda haiguse tohutu arenguga.
Nii võib mõnes piirkonnas esineda seksuaalsete ja mittesuguliste tsüklite vaheldumist, teistes aga ainult mittesugulisi tsükleid.
P. INFESTANSi päritolu
P. infestans ilmus Euroopasse 1991. sajandi esimese poole lõpus. Kuna kartul on pärit Lõuna-Ameerika kirdeosast, eeldati, et parasiit toodi sealt Tšiili salpeetri buumi ajal Euroopasse. Mehhikos Toluca orus Rockefelleri keskuse kartulijaamas tehtud uuringud sundisid seda seisukohta uuesti kaaluma (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. Toluca orus on kohalikel mugulakartuliliikidel (Solanum demissum, S. bulbocastanum jt) vertikaalse resistentsuse erinevad geenikomplektid koos kõrge mittespetsiifilise resistentsuse tasemega, mis näitab parasiidiga pikka koosarengut. Lõuna-Ameerika liikidel, sealhulgas põllukartulitel, puudub resistentsusgeen.
2. Toluca orus on A1 ja A2 paaritumisega isolaate, mille tulemusena on P. infestans'i ristandpopulatsioon laialt levinud; kultuurkartuli kodumaal Lõuna-Ameerikas levib parasiit klooniliselt.
3. Toluca orus on igal aastal tõsiseid hilispõletiku epideemiaid. Seetõttu on Põhja-Ameerika teadlaste (Cornelli ülikool) seas välja kujunenud arvamus Mesoamerica (Kesk-Ameerika) kui kartuli fütoftora sünnikoha kohta (Goodwin et al., 1994).
Lõuna-Ameerika teadlased seda arvamust ei jaga. Nad usuvad, et kultiveeritud kartulil ja selle parasiidil P. infestans on ühine kodumaa - Lõuna-Ameerika Andid. Nad toetasid oma seisukohta mitokondriaalse genoomi (mtDNA) ning tuumageenide RAS ja β-tubuliini DNA polümorfismide analüüsi molekulaarsete uuringutega (Gomez-Alpizar et al., 2007). Nad näitasid, et maailma erinevatest paikadest kogutud tüved pärinesid kolmest erinevast esivanemate liinist, mida (kõiki kolme) leidub Lõuna-Ameerika Andides. Andide haplotüübid on kahe liini järeltulijad: Ecuadoris Anarrhicomenumi sektsioonist leidub metsikult kasvavatel Solanaceae'l vanima mtDNA liini isolaate, teise liini isolaate on levinud kartulitel, tomatitel ja metsloomadel. Tolucas pärinevad isegi haruldased haplotüübid ainult ühest põlvkonnast, kusjuures Toluca tüvede geneetiline varieeruvus (mõnede muutuvate kohtade madal alleelisagedus) viitab hiljutise triivi tõttu tugevale alusmõjule.
Lisaks leiti Andidest uus liik, P. andina, morfoloogiliselt ja geneetiliselt sarnane P. infestansile, mis autorite sõnul osutab Andidele kui perekonna Phytophthora spetsiifika kuumale kohale. Lõpuks, Euroopas ja Ameerika Ühendriikides hõlmavad P. infestansi populatsioonid mõlemat Andide liini, Tolucas aga ainult ühte.
See väljaanne kutsus üles reageerima rühm erinevatest riikidest pärit teadlastelt, kes tegid eelmise uuringu läbivaatamiseks palju eksperimentaalset tööd (Goss jt, 2014). Selles töös kasutati esiteks DNA polümorfismide uurimiseks informatiivsemaid mikrosatelliidi DNA järjestusi; teiseks klastrite, rändeteede, populatsioonide ajalise erinevuse jms analüüsiks. Kasutati arenenumaid mudeleid (F-statistika, Bayesi lähendused jms) ja kolmandaks ei kasutatud võrdlust mitte ainult Andide liikide P. andina, milles tuvastati hübriidne olemus (P. infestans x Phytophthora sp.) aga ka Mehhiko endeemiliste liikide P. mirabilis, P. Ipomoeae ja Phytophthora phaseoli puhul, mis on geneetiliselt lähedased P. infestans, mis kuuluvad samasse klade (Kroon et al., 2012). Nende analüüside tulemusena selgus üheselt, et kõigi uuringusse võetud perekonna Phytophthora kõigi liikide fülogeneetilise puu juurosa, välja arvatud P. andina hübriid, kuulub Mehhiko tüvedesse ja rändevoolu suund on Mehhiko - Andid ja mitte vastupidi ning selle algus langeb kokku Euroopa Uue maailma kolonisatsioon (300–600 aastat tagasi). Seega toimus P. infestans'i liikide, mis olid spetsialiseerunud kartulite kaotamisele, tekkimine mugulaste solanaceae moodustumise sekundaarses geneetilises keskuses, s.t. Kesk-Ameerikas.
P. INFESTANSi genoom
2009. aastal sekveneeris rahvusvaheline teadlaste rühm kogu P infestansi genoomi (Haas et al, 2009), mille suurus oli 240 MB. Seda on mitu korda rohkem kui lähedaste sugulasliikide sojaubade juuremädanikku põhjustavate P. sojae (95 Mb) ja P. Ramorumi (65 Mb) puhul, mõjutades selliseid väärtuslikke puuliike nagu tamm, pöök ja mõned teised. Saadud andmed näitasid, et genoom sisaldab suurt hulka korduvate järjestuste koopiaid - 74%. Genoom sisaldab 17797 valku kodeerivat geeni, millest suurem osa on geenid, mis on seotud rakuprotsessidega, sealhulgas DNA replikatsioon, valkude transkriptsioon ja translatsioon.
Perekonna Phytophthora genoomide võrdlus paljastas genoomi ebatavalise organisatsiooni, mis koosnes konserveeritud geenide järjestuste plokkidest, milles geenitihedus on suhteliselt kõrge ja korduvate järjestuste sisaldus on suhteliselt madal, ja üksikutest piirkondadest, millel on konserveerimata geenijärjestused, madala geenitiheduse ja suure korduvate piirkondade sisaldusega. Konservatiivsed plokid moodustavad 70% (12440) kõigist P. infestans'i valke kodeerivatest geenidest. Konservatiivsetes plokkides paiknevad geenid tavaliselt tihedalt üksteise vahel, keskmise geenidevaheline kaugus 604 aluspaari. Konservatiivsete plokkide vahelistes piirkondades on intergeenne kaugus suurem (3700 bp) korduvate elementide tiheduse kasvu tõttu. Kiiresti arenevad efektor-sekretoorsed geenid asuvad geenivaestes piirkondades.
P. Infestansi genoomi järjestusanalüüs näitas, et ligikaudu üks kolmandik genoomist kuulub transposteeruvate elementide hulka. P. infestansi genoom sisaldab oluliselt rohkem erinevaid transposoonide perekondi kui teised teadaolevad genoomid. Enamik P. infestansi transposone kuulub mustlaste perekonda.
P. infestansi genoomis on tuvastatud suur hulk patogeneesis osalevaid spetsiifilisi geeniperekondi. Neist märkimisväärne osa kodeerib efektorvalke, mis muudavad peremeestaime füsioloogiat ja aitavad kaasa selle nakatumisele. Need jagunevad kahte laia kategooriasse: apoplastilised efektorid, mis toimivad rakkudevahelistes ruumides (apoplastid), ja tsütoplasmaefektorid, mis sisenevad rakkudesse haustoria kaudu. Apoplastiliste efektorite hulka kuuluvad sekreteeritavad hüdrolüütilised ensüümid nagu proteaasid, lipaasid ja glükosülaasid, mis hävitavad taimerakke; peremeestaime kaitseensüümide inhibiitorid ja nekrotiseerivad toksiinid nagu Nep1-sarnased valgud (NPL) ja Pcf-laadsed väikesed tsüsteiinirikkad valgud (SCR).
P. infestansi efektorgeene on palju ja need on tavaliselt suuremad kui mittepatogeensed geenid. Tuntumad on tsütoplasmaefektorid RXLR ja Crinkler (CNR). Oomütseetide tüüpilised tsütoplasmaefektorid on RXLR valgud. Kõik seni avastatud RXLR efektorgeenid sisaldavad amino-terminaalset rühma Arg-XLeu-Arg, kus X on aminohape. Uuringu tulemusena tehti ettepanek, et P. infestans'i genoomis on 563 RXLR-geeni, mis on 60% rohkem kui P. sojae ja P. ramorum'is. Ligikaudu pool P. infestansi genoomi RXLR-geenidest on liigispetsiifilised. RXLR efektoritel on palju erinevaid järjestusi. Nende hulgas tuvastati üks suur ja 150 väikest perekonda. Erinevalt peamisest proteoomist paiknevad RXLR efektorgeenid tavaliselt genoomivaestes ja korduvalt rikastes genoomi piirkondades. Nende piirkondade dünaamilisuse määravad liikuvad elemendid hõlbustavad nende geenide rekombinatsiooni.
Tsütoplasma CRN efektorid tuvastati algselt P. infestansi transkriptides, mis kodeerisid taimekoe nekroosi peptiide. Nende efektide perekonnast on nende avastamisest saadik vähe teada. P. Infestansi genoomi analüüs näitas tohutut 196 CRN-geeni perekonda, mis on palju suurem kui P. sojae (100 CRN) ja P. ramorum (19 CRN) omal. Nagu RXLR-id, on ka CRN-id moodulvalgud ja koosnevad kõrgelt konserveerunud N-terminaalsest LFLAK-i domeenist (50 aminohapet) ja külgnevast DWL-domeenist, mis sisaldab erinevaid geene. Enamikul CRN-idel (60%) on signaalpeptiid.
Uuritud on erinevate CRN-ide võimalust häirida peremeestaime rakuprotsesse. Taimekroosi analüüsimisel võimaldas CRN2 valkude eemaldamine tuvastada C-terminaalse piirkonna, mis koosneb 234 aminohappest (positsioonid 173-407, DXG domeen) ja põhjustab rakusurma. P. infestansi CRN-i geenide analüüs näitas nelja erinevat C-terminaalset piirkonda, mis põhjustavad ka taimes rakusurma. Nende hulka kuuluvad äsja tuvastatud DC-domeenid (P. Infestansil on 18 geeni ja 49 pseudogeeni), samuti D2 (14 ja 43) ja DBF (2 ja 1) domeenid, mis on sarnased valgukinaasidele. Taimes ekspresseeritavad CRN-domeenide valgud konserveeruvad (signaalpeptiidide puudumisel) taimerakus ja stimuleerivad rakusisest mehhanismi abil rakusurma. Veel 255 CRN-domeene sisaldavat järjestust ei toimi tõenäoliselt geenidena.
RXLR ja CRN efektorgeenide perekondade arvu ja suuruse suurenemine oli arvatavasti tingitud alleelse homoloogilise rekombinatsiooni ja geenide dubleerimisest. Hoolimata asjaolust, et genoom sisaldab suurt hulka aktiivseid liikuvaid elemente, pole siiski efektorgeenide ülekandmise kohta otseseid tõendeid.
Rahvastiku struktuuri uurimisel kasutatud meetodid
Populatsioonide geneetilise struktuuri uurimine põhineb praegu selle koostisosade tüvede puhaste kultuuride analüüsil. Populatsioonide analüüsi ilma puhaste kultuuride eraldamiseta viiakse läbi ka konkreetsetel eesmärkidel, näiteks uuritakse populatsiooni agressiivsust või fungitsiididele resistentsete tüvede olemasolu selles (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Seda tüüpi uuringud hõlmavad erimeetodite kasutamist, mille kirjeldus jääb käesoleva ülevaate ulatusest välja. Tüvede võrdleva analüüsi jaoks kasutatakse mitmeid meetodeid, mis põhinevad nii DNA struktuuri analüüsil kui ka fenotüüpsete ilmingute uurimisel. Populatsioonide võrdlev analüüs peab tegelema suure hulga isolaatidega, mis seab kasutatud meetoditele teatud nõuded. Ideaalis peaksid need vastama järgmistele nõuetele (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- olema odav, hõlpsasti rakendatav, ei nõua märkimisväärseid ajakulusid, põhinema üldiselt kättesaadavatel tehnoloogiatel (näiteks PCR);
- peab genereerima piisavalt palju sõltumatuid koodominantseid markeritunnuseid;
- millel on kõrge reprodutseeritavus;
- kasutada minimaalset uuritavat koekogust;
- olema substraadile spetsiifiline (kultuuris esinev saastumine ei tohiks tulemusi mõjutada);
- ei nõua ohtlike protseduuride ja väga mürgiste kemikaalide kasutamist.
Kahjuks ei ole kõigile ülaltoodud parameetritele vastavaid meetodeid. Meie aja tüvede võrdlevaks uurimiseks kasutatakse meetodeid, mis põhinevad fenotüüpsete omaduste analüüsil: virulentsus kartuli- ja tomatisortide suhtes (kartuli- ja tomatirassid), paaritumistüüp, peptidaasi ja glükoos-6-fosfaadi isomeraasi isoensüümide spektrid ning DNA struktuuri analüüs: pikkuse polümorfism restriktsioonifragment (RFLP), mida tavaliselt täiendatakse hübridisatsioonisondiga RG 57, mikrosatelliidi korduste analüüs (SSR ja InterSSR), amplifitseerimine juhuslike praimeritega (RAPD), restriktsioonifragmentide amplifitseerimine (AFLP), amplifitseerimine liikuvate elementide järjestustega homoloogsete praimeritega (näiteks Inter SINE PCR), mitokondrite DNA haplotüüpide määramine.
P. Infestansiga töös kasutatud tüvede võrdleva uurimise meetodite lühikirjeldused
Fenotüüpsete markerite tunnused
"Kartuli" võistlused
“Kartuli” võistlused on tavaliselt uuritud ja kasutatud marker. “Lihtsate kartulite” rassidel on üks geen kartulite virulentsuse jaoks, “keerukate” - vähemalt kaks. Black et al. (1953), kokku võttes kõik nende käsutuses olevad andmed, leidsid, et fütoftoora rass on võimeline nakatama taimi resistentsusgeeniga / geenidega, mis vastavad P. infestans virulentsusgeenile / geenidele, ning leidsid taimi nakatavaid rasse 1, 2, 3 ja 4 geenidega R1, R2, R3 ja R4 vastavalt, s.t. vastastikune mõju parasiidi ja peremeesorganismi vahel toimub vastavalt geeni geeni põhimõttele. Edasi avastas Black Gallegly ja Malcolmsoni osavõtul resistentsusgeenid R5, R6, R7, R8, R9, R10 ja R11 ning vastavad rassid (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Erinevatest piirkondadest pärit patogeeni rassilise koostise kohta on ulatuslik hulk andmeid. Neid andmeid üksikasjalikult analüüsimata toome välja ainult üldise suundumuse: kus kasutati uute resistentsusgeenidega sorte või nende kombinatsioone, oli algul hilispõletik mõnevõrra nõrgenenud, kuid siis ilmnesid vastavate virulentsusgeenidega rassid ja need valiti välja ning hilispõletiku puhangud taastusid. Spetsiifilist virulentsust esimese 4 resistentsusgeeni (R1-R4) vastu täheldati enne nende geenidega sortide kasvatamisse viimist kogutud kollektsioonides harva, kuid virulentsete tüvede arv kasvas järsult, kui patogeeni parasiititi neid geene kandvatel sortidel. Geenid 5–11 olid seevastu kollektsioonides üsna levinud (Shaw, 1991).
Kasvuperioodil 1980. aastate lõpus läbi viidud uuring erinevate rasside suhte kohta näitas, et haiguse arengu alguses on populatsioonis domineerivad madala agressiivsusega kloonid ja 1-2 virulentsusgeeni.
Edaspidi väheneb hilispõletiku tekkimisega algkloonide kontsentratsioon ja suureneb kõrge agressiivsusega "keeruliste" võistluste arv. Viimase esinemine hooaja lõpuks ulatub 100% -ni. Mugulate hoidmisel väheneb agressiivsus ja kaovad üksikud virulentsusgeenid. Kloonide asendamise dünaamika võib esineda erinevates sortides erineval viisil (Rybakova & Dyakov, 1990). Meie uuringud aastatel 2000–2010 on aga näidanud, et nii kartulist kui ka tomatist eraldatud tüvede seas leidub keerulisi rasse juba epifütootika algusest peale. See on tõenäoliselt tingitud P. Infestansi populatsiooni muutumisest Venemaal.
Aastaks 1988-1995 ulatus kõigi või peaaegu kõigi virulentsusgeenidega "superrasside" esinemine erinevates piirkondades 70-100% -ni. Sellist olukorda täheldati näiteks Valgevenes, Leningradi, Moskva oblastis, Põhja-Osseetias ja Saksamaal (Ivanyuk jt, 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin jt, 1995).
"Tomat" võistlused
Tomatisortidest leiti ainult 2 hilispõletikukindluse geeni - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) ja Ph2 (Al-Kherb, 1988). Nagu kartulirasside puhul, toimub tomatite ja P. infestansi vastastikmõju geenipõhiselt. T0 rass nakatab sorte, millel pole resistentsusgeene (enamus tööstuslikult kasutatavaid sorte), T1 rass nakatab Ph1 geeni (Ottawa) ja T2 rass - Ph2 geeniga sorte.
Venemaal leiti kartulitest peaaegu eranditult T0; Hooaja alguses oli tomatitel ülekaalus T0, kuid hiljem asendati see T1 võistlusega (Dyakov et al., 1975, 1994). Pärast 2000. aastat hakkas paljude populatsioonide kartulitel T1 tekkima epifütootilise perioodi alguses. Ameerika Ühendriikides ei olnud kartulitüved tomatile patogeensed, samuti rassid T0, T1 ja T2, samas kui tomatitel olid ülekaalus T1 ja T2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin et al., 1995).
Paaritumistüüp
Uuringu läbiviimiseks on vaja teadaolevaid paaritüüpe testijaid (võrdlus) - A1 ja A2. Testisolaat nakatatakse nendega paarikaupa Petri tassides kaera-agari söötmega. Pärast 10-päevast inkubeerimist uuritakse plaatidel tüvede kontaktvööndis oosporade olemasolu või puudumist. Võimalusi on 4: tüvi kuulub paaritusliiki A1, kui see moodustab oosporoore koos A2 testeriga, A2-le, kui see moodustab oosporoore koos A1 testeriga, A1A2-le, kui see moodustab oosporoore mõlema testeriga või on steriilne (00), kui see ei moodusta oosporoore testijata (kaks viimast rühma on haruldased).
Paaritumise tüüpide kiiremaks kindlaksmääramiseks püüti tuvastada paaritumisega seotud genoomi piirkonnad, eesmärgiga neid kasutada PCR-ga paaritumise tüübi edasiseks kasutamiseks. Üks esimesi edukaid katseid sellise koha tuvastamiseks viisid läbi Ameerika teadlased (Judelson et al., 1995). Kasutades RAPD-meetodit, suutsid nad tuvastada kahe ristatud isolaadi järglastes paaritumistüübiga seotud W16 piirkonna ja kujundada selle võimendamiseks paar 24-bp praimerit (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') ja W16-2 (5') -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Pärast PCR saaduse restriktsiooni restriktsiooniensüümiga HaeIII oli võimalik eraldada isolaadid paaristüüpidega A1 ja A2.
Korea teadlased tegid veel ühe katse PCR-markerite saamiseks paaritumise tüüpide määramiseks (Kim, Lee, 2002). Nad tuvastasid AFLP meetodil konkreetsed tooted. Selle tulemusena töötati välja praimerite paar PHYB-1 (edasi) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') ja PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), mis võimaldas A2 paaritumisega seotud genoomi piirkonna selektiivset võimendamist. Seejärel jätkasid nad seda tööd ja kujundasid praimerid 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, edasi) ja 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), võimaldades paaritumisega tüvedele iseloomulikku Mat-A1 piirkonna selektiivset võimendamist A1. Paaritumistüüpide PCR-diagnostika kasutamine näitas häid tulemusi P. infestansi populatsioonide uurimisel Tšehhi Vabariigis (Mazakova et al., 2006), Tuneesias (Jmour, Hamada, 2006) ja teistes piirkondades. Meie laboris (Mytsa, Elansky, avaldamata) analüüsiti Venemaa erinevates piirkondades (Kostroma, Rjazan, Astrahani, Moskva oblastid) haigestunud kartuli- ja tomatiorganitest eraldatud 34 P. infestans'i tüve. PCR-analüüsi tulemused, milles kasutati spetsiifilisi praimereid rohkem kui 90% ulatuses, langesid kokku traditsioonilise meetodi abil toitumisalusel paaritumistüübi analüüsi tulemustega.
Tabel 1. Resistentsuse varieeruvus Sib 1 kloonis (Elansky et al., 2001)
Proovi kogumise asukoht | Analüüsitud isolaatide arv | Tundlike (S), nõrgalt resistentsete (SR) ja resistentsete (R) tüvede arv, tk (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburgi linn | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahhalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omski oblast | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Metallaksüülresistentsus populatsiooni markerina
1980. aastate alguses täheldati erinevates piirkondades metalaksüülresistentsete P. infestansi tüvede põhjustatud hilise põletiku tugevaid puhanguid. Paljude riikide kartulikasvandused on kandnud märkimisväärseid kaotusi (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse jt, 1983; Derevyagina, 1991). Sellest ajast alates on paljudes maailma riikides pidevalt jälgitud fenüülamiidresistentsete tüvede esinemist P. infestansi populatsioonides. Lisaks fenüülamiidi sisaldavate ravimite kasutamise väljavaadete praktilisele hindamisele, kaitsemeetmete süsteemi ülesehitamisele ja epifüütide ennustamisele on resistentsus nende ravimite suhtes muutunud üheks markeriks, mida kasutatakse selle patogeeni populatsioonide võrdlevas analüüsis. Resistentsus metalaksüüli suhtes tuleks populatsiooni võrdlevates uuringutes siiski läbi viia, võttes arvesse asjaolu, et: 1 - resistentsuse geneetiline alus pole veel täpselt kindlaks määratud, 2 - resistentsus metalaksüüli suhtes on selektiivselt sõltuv omadus, mis võib varieeruda sõltuvalt fenüülamiidide kasutamisest, 3 - erinev tundlikkuse aste metalaksüülitüvede suhtes ühes kloonjoones (tabel. 1).
Isosüümide spektrid
Isosüümimarkerid on tavaliselt välistest tingimustest sõltumatud, näitavad Mendeli pärilikkust ja on koodominantsed, võimaldades teha vahet homo- ja heterosügootidel. Valkude kasutamine geenimarkeritena võimaldab tuvastada nii geneetilise materjali suuri ümberkorraldusi, sealhulgas kromosomaalseid ja genoomseid mutatsioone kui ka üksikute aminohapete asendusi.
Valkude elektroforeetilised uuringud on näidanud, et enamik ensüüme eksisteerib organismides mitme fraktsiooni kujul, mis erinevad elektroforeetilise liikuvuse poolest. Need fraktsioonid tulenevad ensüümide mitmete vormide kodeerimisest erinevate lookuste (isosüümide või isosüümide) või sama lookuse erinevate alleelide (allosüümide või alloensüümide) abil. See tähendab, et isosüümid on ühe ensüümi erinevad vormid. Erinevatel vormidel on sama katalüütiline aktiivsus, kuid need erinevad peptiidi ja vastutavate üksikute aminohapete asenduste poolest veidi. Sellised erinevused ilmnevad elektroforeesi käigus.
P. infestansi tüvede uurimisel kasutatakse kahe valgu, peptidaasi ja glükoos-6-fosfaadi isomeraasi isoensüümide spektreid (see ensüüm on Venemaa populatsioonides monomorfne, seetõttu pole selle uurimise meetodeid käesolevas töös esitatud). Nende eraldamiseks elektriväljal isosüümideks kantakse uuritavatest organismidest eraldatud valgupreparaadid elektrivälja asetatud geelplaadile. Üksikute valkude difusioonikiirus geelis sõltub laengust ja molekulmassist, seetõttu eraldatakse elektriväljas valkude segu üksikuteks fraktsioonideks, mida saab visualiseerida spetsiaalsete värvainete abil.
Peptidaasi isoensüümide uuring viiakse läbi tselluloosatsetaadi, tärklise või polüakrüülamiidi geelidel. Kõige mugavam on Helena Laboratories Inc. toodetud tselluloosatsetaatgeelide kasutamisel põhinev meetod. See ei vaja suuri koguseid katsematerjale, see võimaldab mõlemal ensüümi lookusel elektroforeesi järel geelil saada kontrastsed ribad, selle rakendamine ei nõua suuri aja- ja materjalikulusid (joonis 2).
Väike mütseelitükk viiakse 1,5 ml mikrotorusse, sellele lisatakse 1-2 tilka destilleeritud vett. Pärast seda proov homogeniseeritakse (näiteks mikrotuubi jaoks sobiva plastkinnitusega elektrilise puuriga) ja settitakse 25 sekundit tsentrifuugis kiirusel 13000 pööret minutis. 8 μl igast mikrotuubist. supernatant kantakse aplikaatorplaadile.
Tselluloosatsetaatgeel eemaldatakse puhvermahutist, blotitakse kahe filterpaberi lehe vahel ja asetatakse töökiht aplikaatori plastmassist alusele. Plaadil olev lahus kantakse aplikaatoriga 2–4 korda geelile. Geel kantakse elektroforeesikambrisse,
Tabel 2. Tselluloosatsetaatgeeli värvimiseks kasutatud lahuse koostis peptidaasi isoensüümide analüüsimisel asetatakse geeli servale tilk värvi (bromofenoolsinine).
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0, 2 ml
Peroksidaas, 1000 U / ml 5 tilka
o-dianisidiin, 4 mg / ml 8 tilka
MgCl2, 20 mg / ml 2 tilka
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 tilka
L-aminohappe oksüdaas, 20 u / ml 2 tilka
Elektroforeesi teostatakse 20 minutit. temperatuuril 200 V. Pärast elektroforeesi kantakse geel värvimislauale ja värvitakse spetsiaalse värvimislahusega (tabel 2). 10 ml 1,6% DIFCO agarit sulatatakse eelnevalt mikrolaineahjus, jahutatakse temperatuurini 60 ° C, seejärel segatakse 2 ml agarit värviseguga ja valatakse geelile. Triibud ilmuvad 15-20 minuti jooksul. L-aminohappe oksüdaasi reaktiiv lisatakse vahetult enne lahuse segamist sula agariga.
Venemaa populatsioonides esindavad Pep 1 lookust genotüübid 100/100 ja 92/100. Homosügoot 92/92 on äärmiselt haruldane (umbes 0,1%). Locus Rehr 2 on esindatud kolme genotüübiga 100/100, 100/112 ja 112/112 ning kõik 3 varianti on üsna tavalised (Elanky ja Smirnov, 2003, joonis 2).
Genoomi uurimine
Piirajafragmendi pikkuse polümorfism koos järgneva hübridisatsiooniga (RFLP-RG 57)
Kogu DNA töödeldakse EcoR1 restriktsiooniensüümiga, DNA fragmendid eraldatakse elektroforeesiga agaroosgeelis. Tuuma-DNA on väga suur ja sellel on palju korduvaid järjestusi, mistõttu on restriktsiooniensüümide toimel saadud arvukate fragmentide otsene analüüsimine keeruline. Seetõttu viiakse geelis eraldatud DNA fragmendid spetsiaalsesse membraani ja kasutatakse hübridiseerimiseks sondiga RG 57, mis sisaldab radioaktiivsete või fluorestseeruvate märgistega märgistatud nukleotiide. See sond hübridiseerub korduvate genoomsete järjestustega (Goodwin et al., 1992, Forbes et al., 1998). Pärast valguse või radioaktiivse materjali hübridisatsiooni tulemuste visualiseerimist saadakse hübridisatsiooniprofiil mitme sõrmega (sõrmejälgede võtmine), mida esindab 25–29 fragmenti (Forbes et al., 1998). Aseksuaalsetel (kloonilistel) järglastel on samad profiilid. Elektroforeetogrammi ribade paigutuse järgi saab hinnata võrreldavate organismide sarnasusi ja erinevusi.
Mitokondriaalse DNA haplotüübid
Enamikus eukarüootsetes rakkudes on mtDNA kaheahelalise ümmarguse DNA molekuli kujul, mis erinevalt eukarüootsete rakkude tuumakromosoomidest replikeerub poolkonservatiivselt ja ei ole seotud valgu molekulidega.
P. infestansi mitokondriaalne genoom sekveneeriti ja restriktsioonifragmentide pikkuste analüüsile pühendati mitmeid töid (Carter jt, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Pärast seda, kui Griffith ja Shaw (1998) töötasid välja lihtsa ja kiire meetodi mtDNA haplotüüpide määramiseks, sai see marker P. Infestansi uuringutes üheks populaarsemaks. F2-R2 (tabel 4) ja nende järgnev restriktsiooniensüümide MspI (4. fragment) ja EcoR3 (1. fragment) restriktsioon. Meetod võimaldab teil tuvastada 1 haplotüüpi: Ia, IIa, Ib, IIb. II tüüp erineb I tüübist 2 aluspaari suuruse insertsiooni olemasolu ja restriktsioonisaitide erineva asukoha tõttu P4 ja P1881 piirkonnas (joonis 2).
Alates 1996. aastast märgiti Venemaa territooriumil kogutud tüvede hulgas ainult haplotüüpe Ia ja IIa (Elansky jt, 2001, 2015). Neid saab identifitseerida pärast restriktsiooniproduktide eraldamist praimeriga F2-R2 elektriväljas (joonised 4, 5). Tüvede ja populatsioonide võrdlevas analüüsis kasutatakse mtDNA tüüpe. Mitmetes töödes kasutati kloonjoonte eraldamiseks ja P. infestansi isolaatide pasportierimiseks mitokondriaalse DNA tüüpe (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). PCR-RFLP meetodit kasutades jõuti järeldusele, et mtDNA on heterogeenne samas P. infestansi tüves (Elansky ja Milyutina, 2007). Amplifikatsioonitingimused: 1x (500 s. 94 ° C), 40x (30 s. 90 ° C, 30 s. 52 ° C, 90 s. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reaktsioonisegu: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polümeraas, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq puhver, 0,2 mM iga dNTP, 30 pM praimerit ja 5 ng analüüsitud DNA, deioniseeritud vesi - kuni 20 μl.
PCR produkti piiramine toimub 4-6 tundi temperatuuril 37 ° C. Piirangusegu (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restriktsioonipuhver (2 μl), deioniseeritud vesi (6 μl), PCR produkt (10 μl).
Tabel 3. mtDNA polümorfsete piirkondade amplifitseerimiseks kasutatud praimerid
Locus | Primer | Krundi pikkus ja paigutus | PCR toote pikkus | Restrictase |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619–13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688–14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329–9350 | 964 | EcoRI |
R4: 5 – CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292–10271 |
Juhuslik praimeri võimendamine (RAPD)
RAPD läbiviimisel kasutatakse ühte praimerit (mõnikord mitu praimerit samaaegselt) suvalise nukleotiidjärjestusega, tavaliselt 10 nukleotiidi pikkusega, kõrge (alates 50%) GC nukleotiidide ja madala lõõmutamistemperatuuriga (umbes 35 ° C). Sellised aabitsad "maanduvad" genoomi arvukatele täiendavatele kohtadele. Pärast amplifikatsiooni saadakse suur hulk amplikone. Nende arv sõltub kasutatud praimeritest ja reaktsioonitingimustest (MgCl2 kontsentratsioon ja lõõmutamistemperatuur).
Amplikoonide visualiseerimine toimub destilleerimise teel polüakrüülamiidis või agaroosgeelis. RAPD analüüsi läbiviimisel on vaja hoolikalt jälgida analüüsitava materjali puhtust, sest saastumine teiste elusobjektidega võib põhjustada artefaktide arvu olulist suurenemist, mida on puhta materjali analüüsimisel üsna palju (Perez et al, 1998). Selle meetodi kasutamine P. infestansi genoomi uurimisel kajastub paljudes töödes (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire jt, 2002, Carlisle jt, 2001). Reaktsioonitingimuste ja praimerite valimine (uuriti 51 10-nukleotiidset praimerit) on toodud Abu-El Sameni jt (2003) artiklis.
Mikrosatelliidi kordusanalüüs (SSR)
Mikrosatelliidi kordused (lihtsa järjestuse kordused, SSR) kordavad kõigi eukarüootide tuumgenoomides esinevaid 1-3 (mõnikord kuni 6) nukleotiidi lühikesi järjestusi tandemhaaval. Järjestikuste korduste arv võib varieeruda vahemikus 10 kuni 100. Mikrosatelliidi lookused esinevad üsna suure sagedusega ja on enam-vähem ühtlaselt jaotunud kogu genoomi (Lagercrantz et al., 1993). Mikrosatelliidijärjestuste polümorfism on seotud põhimotiivi korduste arvu erinevustega. Mikrosatelliidimarkerid on koodominantsed, mis võimaldab neid kasutada populatsiooni struktuuri analüüsimiseks, suguluse määramiseks, genotüübi rändeteede määramiseks jne. Nende markerite muude eeliste hulgas tuleb märkida nende suurt polümorfismi, head reprodutseeritavust, neutraalsust ja võimet teostada automaatset analüüsi ja hindamist. Mikrosatelliidi korduste polümorfismi analüüs viiakse läbi PCR-amplifikatsiooniga, kasutades praimereid, mis täiendavad unikaalsete mikrosatelliidi lookustega külgnevaid järjestusi. Esialgu viidi analüüs läbi reaktsiooniproduktide eraldamisega polüakrüülamiidgeelil. Hiljem tegid Applied Biosystems töötajad ettepaneku kasutada fluorestseeruvalt märgistatud praimereid reaktsiooniproduktide tuvastamiseks, kasutades automaatset laserdetektorit (Diehl et al., 1990) ja seejärel standardseid automaatseid DNA järjestajaid (Ziegle et al., 1992). Praimerite märgistamine erinevate fluorestseeruvate värvainetega võimaldab analüüsida korraga mitut markerit ühel rajal ja vastavalt suurendada meetodi tootlikkust ja suurendada analüüsi täpsust.
Esimesed SSR-analüüsi kasutamisele P. infestansi uurimiseks pühendatud publikatsioonid ilmusid 2000. aastate alguses. (Knapova, Gisi, 2002). Kõik autorite pakutud markerid ei näidanud piisavat polümorfismi, kuid kaks neist (4B ja G11) lisati Lees et al. (12) välja pakutud 2006 SSR-markerite komplekti ja võeti seejärel vastu Eucablighti uurimisvõrgus (www.eucablight .org) standardina P. infestansile. Mõni aasta hiljem avaldati uuring P. infestansi DNA multipleksanalüüsi süsteemi loomise kohta, mis põhines kaheksal SSR markeril (Li et al., 2010). Lõpuks, pärast kõigi eelnevalt välja pakutud markerite hindamist ja neist kõige informatiivsema valimist, samuti praimerite, fluorestsentsmärgiste ja amplifikatsioonitingimuste optimeerimist, esitas sama autorite rühm üheastmelise multipleksanalüüsi süsteemi, sealhulgas 12 markerit (tabel 4; Li jt. , 2013a). Selles süsteemis kasutatud praimerid valiti ja märgistati ühe neljast fluorestsentsmarkerist (FAM, VIC, NED, PET), nii et sama märgistusega praimerite alleelisuuruste vahemikud ei kattunud.
Autorid tegid analüüsi PTC200 võimendil (MJ Research, USA), kasutades QIAGEN multipleksseid PCR komplekte või QIAGEN Typeit Microsatellite PCR komplekte. Reaktsioonisegu maht oli 12.5 μL. Amplifikatsioonitingimused olid järgmised: QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 s), 58 ° C (90 s), 72 ° C (60 s), 72 ° C (20 min); QIAGEN Type-it Microsatellite PCR puhul: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek), 58 ° C (90 sekundit), 72 ° C (20 sekundit), 60 ° C (30 min).
PCR produktide eraldamine ja visualiseerimine viidi läbi ABI3730 automaatse kapillaarse DNA analüsaatoriga (Applied Biosystems).
Tabel 4. P. Infestansi genotüübi määramiseks kasutatud 12 standardse SSR-markeri omadused (Li et al., 2013a)
nimi | Alleelide arv | Suuruste vahemik alleelid (bp) | Praimerid |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTACCGATGG R: GTTTCAGGGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCAAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Analüüsitulemuste visualiseerimise näide on toodud joonisel fig. 6. Tulemusi analüüsiti tarkvara GeneMapper 3.7 abil, võrreldes saadud andmeid teadaolevate isolaatide andmetega. Analüüsitulemuste tõlgendamise hõlbustamiseks on vaja igasse uuringusse lisada 1-2 teadaoleva genotüübiga võrdlusisolaati.
Kavandatavat uurimismeetodit testiti märkimisväärsel arvul väliproovides, mille järel autorid ühtlustasid kahe organisatsiooni, The James Huttoni Instituudi (Suurbritannia) ning Wageningeni Ülikooli ja Uuringute (Holland) laborite vahelised protokollid, mis koos võimalusega kasutada lihtsustatud lihtsustamiseks standardseid FTA kaarte P. infestans DNA proovide kogumine ja saatmine võimaldas rääkida selle arenduse äriliseks kasutamiseks. Lisaks võimaldas kiire ja täpne P. infestansi isolaatide genotüpiseerimise meetod multipleksse SSR-analüüsi abil viia läbi selle patogeeni populatsioonide standardiseeritud uuringuid ülemaailmses plaanis ning hilispõletuse ülemaailmse andmebaasi loomist projekti Eucablight raames (www.eucablight.org), sealhulgas , sealhulgas mikrosatelliidi analüüsi tulemused, võimaldasid jälgida uute genotüüpide tekkimist ja levikut kogu maailmas.
Amplifitseeritud restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfism (AFLP). AFLP (amplifitseeritud fragmendi pikkuse polümorfism) on tehnoloogia juhuslike molekulaarsete markerite genereerimiseks, kasutades spetsiifilisi praimereid. AFLP-s töödeldakse DNA-d kahe restriktsiooniensüümi kombinatsiooniga. Spetsiifilised adapterid ligeeritakse restriktsioonifragmentide kleepuvate otstega.
Neid fragmente võimendatakse seejärel, kasutades praimereid, mis on komplementaarsed adapterijärjestuse ja restriktsioonisaidiga, ning kandes lisaks ühte või mitut juhuslikku alust nende 3 'otsas. Saadud fragmentide komplekt sõltub restriktsiooniensüümidest ja juhuslikult valitud nukleotiididest praimeri 3'-otsas (Vos et al., 1995). AFLP - genotüpiseerimise abil uuritakse kiiresti erinevate organismide geneetilisi variatsioone.
Meetodi üksikasjalik kirjeldus on esitatud Mueller, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul jt, 1999. töödes. Hiina teadlased on teinud palju tööd AFLP ja SSR meetodite eraldusvõime võrdlemiseks. Uuriti Põhja-Hiina viies piirkonnas kogutud 48 P. infestansi isolaadi fenotüübi ja genotüübi omadusi. AFLP spektrid näitasid erinevalt SSR genotüüpidest kaheksa erinevat DNA genotüüpi, mille mitmekesisust ei leitud (Guo et al., 2008).
Amplifitseerimine liikuvate elementide järjestustele homoloogsete praimeritega
Retrotransposoonide järjestustest saadud markerid on väga mugavad geneetiliseks kaardistamiseks, geneetilise mitmekesisuse ja evolutsiooniprotsesside uurimiseks (Schulman, 2006). Kui praimerid muudetakse komplementaarseks teatud liikuvate elementide stabiilsete järjestustega, on võimalik nende vahel paiknevaid genoomi piirkondi võimendada. Hilise haavandi tekitaja uurimisel rakendati edukalt meetodit genoomi osade võimendamiseks retrosasooni SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) tuumjärjestusega komplementaarse praimeri abil (Lavrova ja Elansky, 2003). Seda meetodit kasutades ilmnesid erinevused isegi ühe isolaadi mittesugulastel järglastel. Sellega seoses jõuti järeldusele, et SINE-PCR-inter-meetod on väga spetsiifiline ja SINE-elementide liikumiskiirus Phytophthora genoomis on kõrge.
P. infestansi genoomis on tuvastatud 12 lühikeste retrotransposoonide (SINE) perekonda; uuriti lühikeste retrotransposoonide liigilist jaotust, tuvastati elemendid (SINE-d), mida leidub ainult P. infestansi genoomis (Lavrova, 2004).
Tüvede võrdleva uurimise meetodite rakendamise tunnused populatsiooniuuringutes
Uuringu kavandamisel on vaja selgelt mõista eesmärke, mida see taotleb, ja kasutada sobivaid meetodeid. Seega võimaldavad mõned meetodid genereerida suure hulga sõltumatuid markerimärke, kuid on samal ajal vähese reprodutseeritavusega ja sõltuvad tugevalt kasutatavatest reaktiividest, reaktsioonitingimustest ja katsematerjali saastatusest. Seetõttu on igas tüvirühma uurimisel vaja kasutada mitut standardset (võrdlus) isolaati, kuid isegi sel juhul on mitme katse tulemusi väga keeruline kombineerida.
Sellesse meetodite rühma kuuluvad RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Pärast amplifikatsiooni saadakse suur hulk erineva suurusega DNA fragmente. Selliseid tehnikaid on soovitatav kasutada siis, kui on vaja tuvastada erinevusi lähedaste tüvede vahel (vanemad järeltulijad, metsiktüüpi mutandid jne) või juhul, kui on vaja väikese proovi üksikasjalikku analüüsi. Seega kasutatakse AFLP-meetodit laialdaselt P. infestansi geneetilisel kaardistamisel (van der Lee jt, 1997) ja populatsioonisisestes uuringutes (Knapova, Gisi, 2002, Cooke jt, 2003, Flier jt, 2003). Selliseid meetodeid on tüvede andmebaaside loomisel ebapraktiline kasutada, kuna erinevates laborites analüüside tegemisel on praktiliselt võimatu ühtlustada tulemuste arvestust.
Vaatamata näilisele teostuse lihtsusele ja kiirusele (DNA eraldamine ilma hea puhastamiseta, tulemuste amplifitseerimine, visualiseerimine) nõuab see meetodite rühm tulemuste dokumenteerimiseks spetsiaalse meetodi kasutamist: destilleerimine polüakrüülamiidgeelis märgistatud (radioaktiivsete või luminestsents-aluskruntidega) praimeritega ning järgnev valguse või radioaktiivse materjali valgustamine. Tavaline etiidiumbromiidi agaroosgeeli kujutis ei ole nende meetodite jaoks tavaliselt sobiv võib sulanduda suur hulk erineva suurusega DNA fragmente.
Muud meetodid, vastupidi, võimaldavad genereerida vähese arvu tunnuseid nende väga kõrge reprodutseeritavusega. Sellesse rühma kuulub mitokondriaalse DNA haplotüüpide uurimine (Venemaal on märgitud ainult kaks haplotüüpi Ia ja IIa), paaritumistüüp (enamik isolaate jaguneb kahte tüüpi: A2 ja A1, iseviljakat SF leidub harva) ja peptidaasi isosüümspektrid (kaks lookust Pep2 ja Pep1 , mis koosnevad mõlemast isosüümist) ja glükoos-2-fosfaat-isomeraasist (Venemaal pole selle tunnuse varieeruvust, ehkki teistes maailma riikides täheldatakse olulist polümorfismi). Neid funktsioone on soovitatav kasutada kogude analüüsimisel, piirkondlike ja ülemaailmsete andmebaaside koostamisel. Mitokondriaalse DNA isosüümide ja haplotüüpide analüüsi puhul on võimalik üldse ilma standardsete tüvedeta hakkama saada, samas kui paaritumistüüpide analüüsimisel on vaja kahte teadaolevat paaritumistüüpi testisolaati.
Reaktsioonitingimused ja reaktiivid võivad mõjutada ainult toote kontrastsust elektroforetogrammil; artefaktide avaldumine seda tüüpi uuringutes on ebatõenäoline.
Praegu esindavad Venemaa Euroopa osa enamikku populatsioone mõlemat tüüpi paaritumisega tüved (tabel 6), nende hulgas on mitokondriaalse DNA Ia ja IIa tüüpi isolaate (muid maailmas leitud mtDNA tüüpe pole Venemaal pärast 1993. aastat leitud). Peptidaasi isosüümide spektreid esindavad Pep1 lookuses kaks genotüüpi (100/100, 92/92 ja heterosügoot 92/100 ning 92/92 genotüüp on äärmiselt haruldane (<0,3%)) ja Pep 2 lookuses kaks genotüüpi (100/100 , 112/112 ja heterosügoot 100/112, kusjuures genotüüpi 112/112 esineb harvemini kui 100/100, kuid ka üsna sageli).
Glükoos-6-fosfaat-isomeraasi isosüümide spektris ei olnud pärast 1993. aastat varieeruvust (klooniliini US-1 kadumine); kõigil uuritud isolaatidel oli genotüüp 100/100 (Elansky ja Smirnov, 2002).
Kolmas meetodite rühm võimaldab saada piisava kõrge reprodutseeritavusega sõltumatute markerimärkide rühma. Täna hõlmab see rühm RFLP-RG57 sondi, mis toodab 25-29 erineva suurusega DNA fragmenti. RFLP-RG57 saab kasutada nii proovide analüüsimisel kui ka andmebaaside koostamisel. See meetod on siiski palju kallim kui eelmised, see on aeganõudev ja nõuab piisavalt suurt hulka väga puhastatud DNA-d. Seetõttu on teadlane sunnitud testitava materjali mahtu piirama.
RFLP-RG57 areng eelmise sajandi 90. aastate alguses intensiivistas hilispõletiku tekitaja märkimisväärselt populatsiooniuuringuid. See sai meetodi aluseks, mis põhines "Klonaalsete joonte" valimisel ja analüüsimisel (vt allpool). Koos RFLP-RG57-ga kasutatakse kloonjoonte tuvastamiseks paaritumistüüpi, DNA sõrmejälgede võtmist (RFLP-RG57 meetod), peptidaasi ja glükoos-6-fosfaat-isomeraasi isoensüümide spektreid ning mitokondriaalse DNA tüüpi. Tänu temale näidati seda al., 1994), vanade populatsioonide asendamine uutega (Drenth jt, 1993, Sujkowski jt, 1994, Goodwin jt, 1995a), paljastas paljudes maailma riikides valitsevad kloonjooned. Selle meetodi abil tehtud Venemaa tüvede uuringud näitasid Euroopa osa tüvede kõrget genotüübilist polümorfismi ning Venemaa Aasia ja Kaug-Ida piirkondade populatsioonide monomorfismi (Elansky et al, 2001). Ja nüüd jääb see meetod P. infestansi populatsiooniuuringutes peamiseks. Kuid selle laialdast levikut takistab selle teostamise üsna kõrge hind ja töömahukus.
Teine paljulubav tehnika, mida P. infestansi uuringutes kasutatakse harva, on mikrosatelliidi korduse (SSR) analüüs. Praegu kasutatakse seda meetodit laialdaselt kloonjoonte eraldamiseks. Tüvede analüüsimiseks kasutati laialdaselt (ja kasutatakse jätkuvalt) selliseid fenotüüpseid markerijooni nagu virulentsusgeenide olemasolu kartulisortidel (Avdey, 1995, Ivanyuk jt, 2002, Ulanova jt, 2003) ja tomatil. Praeguseks on kartulisortide virulentsuse geenid oma populatsiooniuuringute markerjoonte väärtuse kaotanud, kuna enamikus isolaatides ilmnes virulentsusgeenide maksimaalne (või sellele lähedane) arv. Samal ajal kasutatakse vastavat Ph1 geeni kandvate tomatisortide virulentsusgeeni T1 endiselt edukalt markeri tunnusena (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al., 2003).
Paljudes töödes kasutatakse markerina resistentsust fungitsiidide suhtes. Seda omadust pole populatsiooniuuringutes soovitatav kasutada, kuna klonaalsetes liinides ilmnevad resistentsusmutatsioonid üsna hõlpsalt pärast metalaksüüli (või mefenoksaami) sisaldavate fungitsiidide kasutamist põllul. Näiteks ilmnesid resistentsuse taseme olulised erinevused Sib1 kloonjoone piires (Elansky et al., 2001).
Seega on paaritusliik, peptidaasi isosüümi spekter, mitokondriaalse DNA tüüp, RFLP-RG57, SSR eelistatud markerid andmepankade loomiseks ja tüvede kollektsioonides märgistamiseks. Piiratud proovide võrdlemiseks võite kasutada AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR, kui on vaja kasutada maksimaalset arvu markerfunktsioone (tabel 5). Siiski tuleb meeles pidada, et need meetodid on halvasti reprodutseeritavad ja igas üksikus katses (amplifikatsiooni elektroforeesi tsükkel) on vaja kasutada mitut võrdlusisolaati.
Tabel 5. Tüvede uurimismeetodite võrdlus P. infestans
kriteerium | TC | Isoferi politseisse | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | pööre |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Teabe hulk | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Reprodutseeritavus | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Artefaktide võimalus | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Maksma | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Tööjõu intensiivsus | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analüüsi kiirus ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Märkus: H - madal, C - keskmine, B - kõrge; НС * - agaroosgeeli või automaatse kasutamise korral on töömahukus madal
genotüüp, keskmine - destilleerimisel märgistatud praimeritega polüakrüülamiidgeelil,
** - arvestamata mütseliumi kasvatamiseks kulutatud aega DNA eraldamiseks.
Rahvastiku struktuur
Kloonjooned
Rekombinatsiooni puudumisel või selle ebaolulisel panusel populatsiooni struktuuri koosneb populatsioon teatud hulgast kloonidest, mille geneetiline vahetus on äärmiselt haruldane.
Sellistes populatsioonides on informatiivsem uurida mitte üksikute geenide sagedusi, vaid genotüüpide sagedusi, millel on ühine päritolu (kloonjooned või kloonjooned) ja mis erinevad ainult punktmutatsioonide poolest. Hilispõletiku patogeeni populatsiooniuuringud ja kloonjoonte analüüs on pärast RFLP-RG57 meetodi tulekut eelmise sajandi 90ndate alguses märkimisväärselt kiirenenud. Koos RFLP-RG57-ga kasutatakse kloonjoonte tuvastamiseks paaritumistüüpi, peptidaasi ja glükoos-6-fosfaadi isomeraasi isoensüümide spektreid ning mitokondriaalse DNA tüüpi. Kõige tavalisemate kloonjoonte omadused on toodud tabelis 6.
Kloon US-1 domineeris populatsioonides kõikjal kuni 80. aastate lõpuni, pärast seda hakati seda asendama teiste kloonidega ning kadus Euroopast ja Põhja-Ameerikast. Nüüd on seda leitud Kaug-Idas (Filipiinid, Taiwan, Hiina, Jaapan, Korea, Koh et al., 1994, Mosa et al, 1993), Aafrikas (Uganda, Kenya, Rwanda, Goodwin et al, 1994, Vega-Sanchez et al., 2000; Ochwo jt, 2002) ja Lõuna-Ameerikas (Ecuador, Brasiilia, Peruu, Forbes jt, 1997, Goodwin jt, 1994). Ainuüksi Austraalias pole tuvastatud ühtegi USA-1 liini tüve. Ilmselt tulid P. infestansi isolaadid Austraaliasse uue rändelaine abil (Goodwin, 1997).
Kloon US-6 rändas 70. aastate lõpus Mehhiko põhjaosast Californiasse ja põhjustas 32 aastat ilma haiguseta kartulis ja tomatis epideemia. Suure agressiivsuse tõttu tõrjus ta USA-1 klooni ümber ja hakkas domineerima Ameerika Ühendriikide läänerannikul (Goodwin et al., 1995a).
Genotüübid US-7 ja US-8 avastati USA-s 1992. aastal ning juba 1994. aastal levitati neid laialdaselt Ameerika Ühendriikides ja Kanadas. Ühe põldhooaja jooksul suudab kloon US-8 peaaegu täielikult välja tõrjuda klooni US-1 kartuliplatsidel, mis olid nakatunud mõlema klooniga võrdses kontsentratsioonis (Miller ja Johnson, 2000).
Kloonid BC-1 kuni BC-4 on tuvastatud Briti Columbias vähesel arvul isolaatidest (Goodwin et al., 1995b). Kloon US-11 levis Ameerika Ühendriikides laialdaselt ja tõrjus Taiwanis USA-1. Kloonid JP-1 ja EC-1 koos klooniga US-1 on Jaapanis ja Ecuadoris levinud vastavalt (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 on kloon, mis valitses Venemaal tohutul territooriumil Moskva oblastist Sahhalinini. Moskva piirkonnas avastati see 1993. aastal ja mõned välipopulatsioonid koosnesid peamiselt selle klonaalse joone tüvedest, mis olid metallaksüülile väga vastupidavad. Pärast 1993. aastat vähenes selle klooni levimus märkimisväärselt. Aastatel 1997–1998 leidus väljaspool Uuralit SIB-1 kõikjal, välja arvatud Khabarovski territoorium (kloon SIB-2 on seal laialt levinud). Erinevat tüüpi paaritumisega kloonide ruumiline eraldamine välistab seksuaalprotsessi Siberis ja Kaug-Idas. Moskva piirkonnas esindavad elanikkonda erinevalt Siberiast paljud kloonid; peaaegu igal isolaadil on ainulaadne multilookuse genotüüp (Elansky et al., 2001, 2015). Seda mitmekesisust ei saa seletada üksnes seenetüvede impordiga maailma erinevatest piirkondadest koos imporditud seemnematerjaliga. Kuna populatsioonis esineb mõlemat tüüpi paaritumist, on võimalik, et selle mitmekesisus tuleneb ka rekombinatsioonist. Seega eeldatakse Briti Columbias genotüüpide BC-2, BC-3 ja BC-4 tekkimist kloonide BC-1 ja US-6 hübridiseerumise tõttu (Goodwin et al., 1995b). Võimalik, et Moskva populatsioonides leidub hübriidseid tüvesid. Näiteks võivad PEP lookuse jaoks heterosügootsed tüved MO-4, MO-8 ja MO-11 olla tüvede MO-12, MO-21, MO-22 hübriidid, millel on A2-tüüpi paaritus ja homosügootne PEP-lookuse ja tüve ühe alleeli jaoks. MO-8, millel on A1 tüüpi paaritus ja mis on lookuse teise alleeli suhtes homosügootne. Ja kui see nii on ja P. infestansi tänapäevastes populatsioonides on tendents seksuaalprotsessi rolli suurenemisele, siis mitmefookusega kloonide analüüsi infoväärtus väheneb (Elansky et al., 2001, 2015).
Kloonjoonte variatsioon
Kuni 90. sajandi 20. aastateni oli kloonjoon US-1 maailmas laialt levinud. Suurem osa põllu- ja piirkondlikest populatsioonidest koosnes eranditult US-1 genotüübiga tüvedest. Siiski täheldati ka isolaatide erinevusi, mis on tõenäoliselt põhjustatud mutatsiooniprotsessist. Mutatsioonid toimusid nii tuuma- kui ka mitokondriaalse DNA-s ning mõjutasid muu hulgas resistentsuse taset fenüülamiidravimite suhtes ja virulentsusgeenide arvu. Jooned, mis algsest genotüübist erinevad mutatsioonide poolest, on tähistatud täiendavate numbritega pärast punkti, mis järgneb algse genotüübi nimele (näiteks US-1.1 kloonjoon mutantjoon US-1). Sõrmejälgedega DNA liinid US-1.5 ja US-1.6 sisaldavad erineva suurusega lisajooni (Goodwin et al., 1995a, 1995b); kloonjoon US-6.3 erineb ka US-6-st ühe lisajoonega (Goodwin, 1997, tabel 7).
Mitokondriaalse DNA uuringus leiti, et klooniliinis US-1 leidub ainult 1.b tüüpi mitokondriaalne DNA (Carter et al., 1990). Kuid Peruust ja Filipiinidelt pärineva selle klonaalse liini tüvede uurimisel leiti isolaate, mille mitokondriaalse DNA tüübid erinesid insertsioonide ja deletsioonide olemasolu korral 1b-st (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabel 6. Mõnede P. infestansi kloonjoonte multokookusega genotüübid
nimi | Paaritumistüüp | Isosüümid | DNA sõrmejäljed | MtDNA tüüp | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EÜ-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Märkus: * - andmed puuduvad.
Tabel 7. Mitmekordse fookuse genotüübid ja nende mutantsed jooned
nimi | Paaritumistüüp | | DNA sõrmejäljed (RG57) | Märkused | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Algne genotüüp 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutatsioon PEP-s |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutatsioon RG57-s |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutatsioon RG57-s |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutatsioon RG57 ja PEP korral |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutatsioon RG57-s |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Algne genotüüp 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutatsioon PEP-s |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutatsioon RG57-s |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutatsioon RG57-s |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutatsioon RG57 ja PEP korral |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutatsioon RG57-s |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Algne genotüüp 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutatsioon RG57-s |
Muutusi on ka isosüümide spektrites. Reeglina on need põhjustatud selle ensüümi jaoks algselt heterosügootse organismi lagunemisest homosügootseteks. 1993. aastal tuvastasime tomativiljadel tüve, millel olid US-1-le iseloomulikud tunnused: RG57 sõrmejälgede võtmine, mitokondriaalse DNA tüüp ja 86/100 glükoos-6-fosfati-isomeraasi genotüüp, kuid esimese peptidaasi lookuse puhul oli see homosügootne (100/100) sellele kloonjoonele tüüpiline 92/100 heterosügoot. Nimetasime selle tüve genotüübi MO-17 (tabel 6). Mutantliinid US-1.1 ja US-1.4 erinevad ka US-1-st mutatsioonide poolest esimese peptidaasi lookuses (tabel 7).
Kartulite ja tomatite sortide virulentsusgeenide arvu muutumist põhjustavad mutatsioonid on üsna tavalised. Neid täheldati klooniliini US-1 isolaatide hulgas populatsioonides Hollandist (Drenth et al., 1994), Peruust (Goodwin et al., 1995a), Poolast (Sujkowski et al., 1991), Põhja-Ameerika põhjaosast (Goodwin et al., 1995). ., 7b). Kartulite virulentsusgeenide arvu erinevusi täheldati ka klooniliinide US-8 ja US-1995 isolaatide seas Kanadas ja Ameerika Ühendriikides (Goodwin et al., 1a), SIB-2001 liini isolaatide seas Venemaa Aasia osas (Elansky et al, XNUMX ).
Fenüülamiidravimite suhtes resistentsuse tasemete tugevate erinevustega isolaate tuvastati monoklonaalsete väljade populatsioonides, mis kõik kuulusid kloonjoonele Sib-1 (Elansky jt, 2001, tabel 1). Peaaegu kõik klooniliini US-1 tüved on metalaksüülile väga vastuvõtlikud, kuid selle liini väga resistentsed isolaadid eraldati Filipiinidel (Koh et al., 1994) ja Iirimaal (Goodwin et al., 1996).
P. infestansi tänapäevased populatsioonid
Kesk-Ameerika (Mehhiko)
Mehhiko P. infestansi populatsioon erineb märkimisväärselt teistest maailma populatsioonidest, mis on peamiselt tingitud selle ajaloolisest positsioonist. Selle populatsiooni ja sellega seotud P. phytophthora sugukonna P. infestans liikide ning perekonna Solanum kohalike liikide arvukad uuringud viisid järeldusele, et patogeeni areng Mehhiko keskosas toimus koos peremeestaimede arenguga ja oli seotud seksuaalse rekombinatsiooniga (Grünwald, Flier , 2005). Mõlemad paaritumistüübid on esindatud populatsioonis ja võrdses vahekorras ning oosporide esinemine mullas, kartulite taimedel ja mugulatel ning metsikutel sugulasliikidel Solanum kinnitab seksuaalse protsessi esinemist populatsioonis (Fernández-Pavía et al., 2002). Hiljutised uuringud Toluca oru ja selle ümbruse kohta (patogeeni eeldatav tekkekeskus) kinnitasid P. infestans'i kohaliku populatsiooni suurt geneetilist mitmekesisust (134 multilookuse genotüüpi 176 proovist koosnevas proovis) ja mitmete diferentseeritud alarühmade olemasolu piirkonnas (Wang et al., 2017). Sellist diferentseerimist soodustavad tegurid on Kesk-Mehhiko mägismaale iseloomulikud alampopulatsioonide ruumiline jagunemine, viljelustingimuste ja orgudes ning mägedes kasutatavate kartulisortide erinevused ning looduslike mugulate Solanum liikide olemasolu, mis võivad toimida alternatiivsete peremeestena (Fry et al. ., 2009).
Siiski tuleb märkida, et Põhja-Mehhiko P. infestansi populatsioonid on oma olemuselt kloonilisemad ja sarnanevad rohkem Põhja-Ameerika populatsioonidega, mis võib viidata sellele, et tegemist on uute genotüüpidega (Fry et al., 2009).
Põhja-Ameerika
Põhja-Ameerika P. infestans populatsioonidel on alati olnud väga lihtne struktuur ja nende klooniline iseloom sai paika juba ammu enne mikrosatelliidi analüüsi kasutamist. Kuni 1987. aastani domineeris USA-s ja Kanadas kloonjoon US-1 (Goodwin et al., 1995). 70. aastate keskel, kui ilmusid metalaksüülil põhinevad fungitsiidid, hakati seda klooni asendama teiste, Mehhikost migreerunud resistentsemate genotüüpidega (Goodwin et al., 1998). 90ndate lõpuks. genotüüp US-8 asendas USA-s täielikult USA-1 genotüübi ja sellest sai kartulite domineeriv klooniliin (Fry et al., 2009; Fry et al., 2015). Erinev olukord oli tomatitega, mis sisaldasid pidevalt mitut kloonjoont ja nende koostis muutus aasta-aastalt (Fry et al., 2009).
2009. aastal puhkes Ameerika Ühendriikides tomatite peal ulatuslik hilispõletiku epideemia. Selle pandeemia tunnuseks oli selle peaaegu samaaegne algus paljudes kohtades Ameerika Ühendriikide kirdeosas ja see osutus seotuks nakatunud tomatiseemikute massilise müügiga suurtes aianduskeskustes (Fry et al., 2013). Saagikadu oli tohutu. Mõjutatud proovide mikrosatelliitanalüüs näitas, et pandeemiline tüvi kuulus klooniliini US-22 A2-tüüpi paaritumisse. 2009. aastal ulatus selle genotüübi osakaal P. infestans'i Ameerika populatsioonis 80% -ni (Fry et al., 2013). Järgnevatel aastatel kasvas agressiivsete genotüüpide US-23 (peamiselt tomatitel) ja US-24 (kartulitel) osakaal populatsioonis pidevalt, kuid pärast 2011. aastat vähenes USA-24 avastamismäär märkimisväärselt ja praeguseks on umbes 90% patogeenide populatsioonist Ameerika Ühendriike esindab US-23 genotüüp (Fry et al., 2015).
Kanadas, nagu ka Ameerika Ühendriikides, 90ndate lõpus. domineeriva genotüübi US-1 tõrjus välja US-8, mille domineerivad positsioonid püsisid muutumatuna kuni 2008. aastani. Kanadas esines nakatunud tomati seemikute müügiga tõsiseid hilispõletiku epideemiaid, kuid need olid põhjustatud genotüüpidest US-2009 ja US-2010 (Kalischuk et al., 23). Nende genotüüpide selge geograafiline eristumine oli tähelepanuväärne: USA läänepoolsed provintsid Kanada domineerisid USA-8 (2012%), idapoolsetes provintsides (23%) aga USA-68. Järgnevatel aastatel levis USA-8 idapiirkondadesse, kuid üldiselt vähenes selle osatähtsus rahvastikus veidi USA-83 ja US-23 genotüüpide ilmumise taustal (Peters et al., 22). Siiani on USA-24 domineeriv seisund kogu Kanadas; USA-2014 on olemas Briti Columbias, samas kui USA-23 ja US-8 on Ontarios (Peters, 23).
Seega on P. infestansi Põhja-Ameerika populatsioonid peamiselt kloonjooned. Viimase 40 aasta jooksul on tuvastatud klonaalsete genotüüpide arv jõudnud 24. Vaatamata asjaolule, et populatsioonis esineb mõlemat tüüpi paaritumist, on uute genotüüpide ilmnemise tõenäosus seksuaalse rekombinatsiooni tagajärjel üsna väike. Sellegipoolest on viimase 20 aasta jooksul registreeritud mitmeid lühiajaliste rekombinantsete populatsioonide ilmnemise juhtumeid (Gavino jt, 2000; Danies jt, 2014; Peters jt, 2014) ja ühel juhul oli ristumise tulemus genotüüp US-11 , mis oli Põhja-Ameerikas juurdunud aastaid (Gavino et al., 2000). Kuni 2009. aastani olid populatsioonide struktuuri muutused seotud uute, agressiivsemate genotüüpide ilmnemisega koos nende järgneva migratsiooni ja varem domineerivate eelkäijate ümberasustamisega. Mis juhtus aastatel 2009-2010 USA-s ja Kanadas näitasid epifütootikumid esmakordselt, et üleilmastumise ajastul võib nakatunud istutusmaterjali müümisel seostada haiguse puhanguid uute genotüüpide aktiivse levikuga.
Lõuna-Ameerika
Alles hiljuti ei olnud P. infestans'i Lõuna-Ameerika populatsioonide uuringud regulaarsed ega ulatuslikud. On teada, et nende populatsioonide struktuur on üsna lihtne ja hõlmab 1–5 klonaalset liini riigi kohta (Forbes et al., 1998). Seega on 1998. aastaks genotüübid US-1 (Brasiilia, Tšiili) BR-1 (Brasiilia, Boliivia, Uruguay, Paraguay), EC-1 (Ecuador, Colombia, Peruu ja Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 ja AR-5 (Argentina), PE-3 ja PE-7 (Peruu lõunaosa). Paaritumistüüp A2 oli olemas Brasiilias, Boliivias ja Argentinas ning seda ei leitud väljaspool Boliivia-Peruu piiri Titicaca järve piirkonnas, mille taga Andides domineeris EC-1 A1 genotüüp. Tomatite puhul jäi USA-1 kogu Lõuna-Ameerikas domineerivaks genotüübiks.
Enam-vähem püsis olukord 2000. aastatel. Oluliseks punktiks oli uue A2-tüüpi kloonjoone EC-2 avastamine Põhja-Andides kartulite (S. brevifolium ja S. tetrapetalum) metsikutel sugulastel (Oliva et al., 2010). Fülogeneetilised uuringud on näidanud, et see liin ei ole P. infestansiga täiesti identne, ehkki see on sellega tihedalt seotud, tehti sellega seoses ettepanek kaaluda seda, samuti Andides kasvavast tomatipuust S. betaceum isoleeritud teine liin EC-3, uus liik nimega P. andina; selle liigi (iseseisev liik või P. infestansi hübriid mõne seni tundmatu joonega) staatus on aga endiselt ebaselge (Delgado et al., 2013).
Praegu on kõik Lõuna-Ameerika P. infestans populatsioonid kloonilised. Vaatamata mõlemat tüüpi paaritumisele ei ole rekombinantseid populatsioone tuvastatud. Tomatitel on US-1 genotüüp kõikjal levinud, ilmselt tõrjusid kartulid välja kohalikud tüved, mille täpne päritolu pole veel teada. Brasiilias, Boliivias ja Uruguays on BR-1 genotüüp; Peruus on koos US-1 ja EC-1 veel mitmeid teisi kohalikke genotüüpe. Andides hoiab domineerivat positsiooni kloonjoon EC-1, mille suhe hiljuti avastatud P. andinaga jääb teadmata. Ainus "ebastabiilne" koht, kus ajavahemikuks 2003-2013. rahvaarvus toimusid olulised muutused, sai Tšiili (Acuña et al., 2012), kus 2004. – 2005. patogeenide populatsiooni iseloomustas resistentsus metalaksüüli suhtes ja uus mitokondriaalse DNA haplotüüp (varem olemasoleva Ib asemel Ia). 2006–2011 populatsioonis domineeris genotüüp 21 (vastavalt SSR-ile), mille osakaal ulatus 90% -ni, misjärel peopesa läks üle genotüübile 20, mille esinemissagedus järgmise kahe aasta jooksul hoiti umbes 67% (Acuña, 2015).
Euroopa
Euroopa ajaloos oli vähemalt kaks P. infestansi rändelainet Põhja-Ameerikast: 1. sajandil. (HERB-1) ja 70. sajandi algus (US-1). Metalaksüüli sisaldavate fungitsiidide üldlevinud levik XNUMX. aastatel. viis domineeriva genotüübi US-XNUMX nihutamiseni ja selle asendamiseni uute genotüüpidega. Selle tulemusena olid enamikus Lääne-Euroopa riikides patogeeni populatsioonid esindatud peamiselt mitme kloonjoonega.
Mikrosatelliitanalüüsi kasutamine patogeenide populatsioonide analüüsimiseks võimaldas tuvastada tõsised muutused, mis toimusid Lääne-Euroopas aastatel 2005–2008. 2005. aastal avastati Ühendkuningriigis uus kloonjoon 13_A2 (või „Blue 13”) ja seda iseloomustas A2 paaritumistüüp , kõrge agressiivsus ja vastupidavus fenüülamiididele (Shaw et al., 2007). Sama genotüüp leiti 2004. aastal Hollandist ja Põhja-Prantsusmaalt kogutud proovidest, mis viitas sellele, et see rändas Mandri-Euroopast Suurbritanniasse, võib-olla koos seemnekartulitega (Cooke et al., 2007). Selle kloonjoone esindajate genoomi uuring näitas selle järjestuse suurt polümorfismi (aastaks 2016 ulatus selle subklonaalsete variatsioonide arv 340-ni) ja geeniekspressiooni taseme olulist varieeruvust, sh. efektorgeenid taimede nakatumise ajal (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Need omadused koos biotroofse faasi pikenenud kestusega võivad põhjustada 13_A2 suurenenud agressiivsust ja selle võimet nakatada isegi hilispõletikule vastupidavaid kartulisorte.
Järgnevatel aastatel levis genotüüp kiiresti Loode-Euroopa riikides (Suurbritannia, Iirimaa, Prantsusmaa, Belgia, Holland, Saksamaa) varem domineerivate genotüüpide 1_A1, 2_A1, 8_A1 üheaegse tõrjumisega (Montarry jt, 2010; Gisi jt. , 2011; Van den Bosch jt, 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Veebisaidi www.euroblight.net andmetel ulatus 13_A2 osakaal nende riikide populatsioonides 60–80% ja rohkem; selle genotüübi olemasolu on registreeritud ka mõnes Ida- ja Lõuna-Euroopa riigis. Kuid 2009. – 2012. 13_A2 kaotas oma domineeriva positsiooni Suurbritannias ja Prantsusmaal, andes järele 6_A1 joonele (Iirimaal 8_A1) ning Hollandis ja Belgias asendati see osaliselt genotüüpidega 1_A1, 6_A1 ja 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Praeguseks on umbes 70% Lääne-Euroopa P. infestans populatsioonist monoklonaalsed. Veebisaidi www.euroblight.net andmetel on Loode-Euroopa riikides (Suurbritannias, Prantsusmaal,
Holland, Belgia) jäävad ligikaudu võrdses vahekorras 13_A2 ja 6_A1 ning viimast praktiliselt ei esine väljaspool nimetatud piirkonda (välja arvatud Iirimaa), kuid sellel on juba vähemalt 58 alamklooni (Cooke, 2017). Variatsioone 13_A2 on Saksamaal märgatavalt palju ning neid on juhuslikult täheldatud ka Kesk- ja Lõuna-Euroopa riikides. Genotüüp 1_A1 moodustab olulise osa Belgia ning osaliselt ka Hollandi ja Prantsusmaa populatsioonidest. Genotüüp 8_A1 on Euroopa elanikkonnas stabiliseerunud 3-6% tasemel, välja arvatud Iirimaa, kus see säilitab liidripositsiooni ja jaguneb kaheks alaklooniks (Stellingwerf, 2017). Lõpuks, 2016. aastal suurenes uute genotüüpide 36_A2 ja 37_A2 esinemissagedus, mis registreeriti esmakordselt aastatel 2013-2014; tänaseks on neid genotüüpe Hollandis ja Belgias ning osaliselt Prantsusmaal ja Saksamaal, samuti Suurbritannia lõunaosas (Cooke, 2017). Igal aastal esindavad unikaalsed genotüübid ligikaudu 20–30% Lääne-Euroopa elanikkonnast.
Erinevalt Lääne-Euroopast ei olnud 13_A2 genotüübi ilmumise ajaks Põhja-Euroopa (Rootsi, Norra, Taani, Soome) populatsioone esindatud mitte kloonjoonte, vaid suure hulga unikaalsete genotüüpidega (Brurberg et al.
2011). 13_A2 aktiivse leviku perioodil Lääne-Euroopas märgati selle genotüübi esinemist Skandinaavias alles 2011. aastal, kui see avastati esmakordselt Põhja-Jüütimaal (Taani), kus kasvatatakse peamiselt tööstuslikke kartulisorte, kus aktiivselt kasutatakse metalaksüüli sisaldavaid fungitsiidid (Nielsen et al., 2014). Www.euroblight.net andmetel tuvastati genotüüp 13_A2 2014. aastal ka mitmest Norrast ja Taanist pärit proovist ning 2016. aastal mitmest Norra proovist; lisaks märgiti 2013. aastal Soomes genotüübi 6_A1 olemasolu väikeses koguses. Skandinaavia vallutamisel 13_A2 ja teiste kloonjoonte ebaõnnestumise peamiseks põhjuseks peetakse selle piirkonna klimaatilisi erinevusi Lääne-Euroopa riikidest.
Lisaks sellele, et jahedad suved ja külmad talved soodustavad mitte niivõrd vegetatiivse seeneniidistiku kui oosporide ellujäämist (Sjöholm et al., 2013), aitab oosporode idanemisele ja istutamisele kaasa ka mulla külmumine talvel (mida Lääne-Euroopa soojemates riikides tavaliselt ei esine). kartul, mis suurendab nende rolli esmase nakkuse allikana (Brurberg et al., 2011). Samuti tuleb märkida, et põhjapoolsetes oludes ületab oosporide nakkuse areng mugulainfektsiooni arengut, mis lõpuks hoiab ära veelgi agressiivsemate, kuid hiljem arenenud kloonjoonte domineerimise (Yuen, 2012). Ida-Euroopa riikide (Poola, Balti riigid) kõige enam uuritud P. infestans populatsioonide struktuur on Skandinaavias väga sarnane.
Mõlemad paaritumistüübid esinevad ka siin ja valdav enamus SSR-analüüsiga määratud genotüüpidest on ainulaadsed (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Nagu Põhja-Euroopas, ei mõjutanud kloonjoonte (peamiselt 13_A2 genotüübi) levik patogeeni kohalikke populatsioone, mis säilitavad kõrge mitmekesisuse taseme ilma väljendunud domineerivate joonteta.
Kaubanduslike kartulisortidega põldudel täheldatakse aeg-ajalt 13_A2 esinemist. Venemaal areneb olukord sarnaselt. Aastatel 2008-2011 kogutud P. infestansi isolaatide mikrosatelliitanalüüs Venemaa Euroopa osa kümnes erinevas piirkonnas näitasid genotüübilist mitmekesisust ja Euroopa kloonjoonte kokkulangevuste täielikku puudumist (Statsyuk et al., 10). Mitu aastat hiljem näitas Leningradi oblastis aastatel 2014–2013 kogutud P. infestans'i proovide uuring märkimisväärseid erinevusi nende ja eelmises uuringus tuvastatud selle piirkonna genotüüpide vahel. Mõlemas uuringus ei leitud Lääne-Euroopa genotüüpe (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2014).
P. infestansi Ida-Euroopa populatsioonide kõrge geneetiline mitmekesisus ja domineerivate kloonjoonte puudumine neis võivad olla seotud mitme põhjusega. Esiteks, nagu Põhja-Euroopas, aitavad vaadeldavate riikide kliimatingimused kaasa oosporide kui esmase nakkusallika tekkele (Ulanova et al., 2010; Chmielarz et al., 2014). Teiseks kasvatatakse märkimisväärset osa nendes riikides toodetud kartulitest väikestes erataludes, sageli ümbritsevad metsad või muud nakkusliku materjali vaba liikumise takistused (Chmielarz et al., 2014). Reeglina sellistes tingimustes kasvatatud kartuleid kemikaalidega praktiliselt ei töödelda ja sortide valik põhineb nende hilisel lõtkukindlusel, s.t. puudub selektiivne surve agressiivsusele ja resistentsusele metalaksüüli suhtes, mis jätab resistentsed genotüübid, näiteks 13_A2, eelisteks teiste genotüüpide ees (Chmielarz et al., 2014). Lõpuks, maatükkide väikese suuruse tõttu ei praktiseeri nende omanikud tavaliselt külvikorda, kasvatades kartuleid aastaid samas kohas, mis aitab kaasa geneetiliselt mitmekesise inokulaadi kuhjumisele (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Aasia
Alles hiljuti oli P. infestansi populatsioonide struktuur Aasias suhteliselt halvasti mõistetav. Oli teada, et seda esindavad peamiselt kloonjooned ning seksuaalse rekombinatsiooni mõju uute genotüüpide tekkele on väga väike. Nii näiteks aastatel 1997-1998. Venemaa Aasia osas (Siberis ja Kaug-Idas) esindas patogeenide populatsiooni ainult kolm genotüüpi, kus SIB-1 genotüüp oli ülekaalus (Elansky et al., 2001). Kloonsete patogeeniliinide olemasolu on näidatud sellistes riikides nagu Hiina, Jaapan, Korea, Filipiinid ja Taiwan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klooniline joon US-1, mis domineeris suurel Aasia territooriumil, 90ndate lõpus - 2000ndate alguses. peaaegu kõikjal hakkasid asenduma muud genotüübid, mis omakorda andsid teed uutele. Enamasti olid Aasia riikide populatsioonide struktuuri ja koosseisu muutused seotud uute genotüüpide rändega väljastpoolt. Seega on Jaapanis, välja arvatud JP-3 genotüüp, kõigil teistel pärast US-1 ilmunud Jaapani genotüüpidel (JP-1, JP-2, JP-3) enam-vähem tõestatud väline päritolu (Akino et al., 2011) ... Hiinas on praegu kolm peamise selge geograafilise jaotusega patogeenide populatsiooni; Nende populatsioonide vahel puudub või on väga nõrk geenivoog (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotüüp 13_A2 ilmus Hiina territooriumil selle lõunapoolsetes provintsides (Yunnan ja Sichuan) aastatel 2005-2007 ja 2012-1014. oli näha ka riigi kirdes (Li jt, 2013b). Indias ilmnes 13_A2 arvatavasti samal ajal kui Hiinas, tõenäoliselt nakatunud seemnekartulitega (Chowdappa et al., 2015) ja aastatel 2009–2010. põhjustas riigi lõunaosas tomatile tõsise hiljapõletiku epifütootilise haiguse, misjärel see levis kartulile ja põhjustas 2014. aastal Lääne-Bengalis hilispõletiku puhangu, mis viis paljude kohalike põllumeeste hävitamiseni ja enesetappudeni (Fry, 2016).
Африка
Kuni 2008-2010 Aafrika riikides ei ole P. infestans süstemaatilisi uuringuid läbi viidud. Praegu võib P. infestans'i Aafrika populatsioonid jagada kahte rühma ja see jagunemine on selgelt seotud seemnekartuli impordi Euroopaga.
Põhja-Aafrikas, mis impordib aktiivselt seemnekartulit Euroopast, on A2 paaritumistüüp laialdaselt esindatud peaaegu kõigis piirkondades, mis annab teoreetilise võimaluse uute genotüüpide tekkeks seksuaalse rekombinatsiooni tulemusena (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Lisaks märgitakse Alžeerias genotüüpide 13_A2, 2_A1 ja 23_A1 olemasolu, kusjuures esimeses neist on selgelt väljendunud domineerimine, samuti unikaalsete genotüüpide osakaalu järkjärguline vähenemine täieliku kadumiseni (Rekad et al., 2017). Erinevalt muust piirkonnast esindab Tuneesias (välja arvatud riigi kirdeosa) patogeenide populatsiooni peamiselt A1 paaritumistüüp (Harbaoui et al., 2014).
Klooniline joon NA-01 on siin domineeriv. Üldiselt on kloonjoonte osakaal populatsioonis vaid 43%. Ida- ja Lõuna-Aafrikas, kus seemnete impordi mahud on kaduvväike (Fry et al., 2009), esindavad P. infestansit ainult kaks kloonilist A1-tüüpi joont US-1 ja KE-1 ning viimane tõrjub esimese kartulil aktiivselt ( Pule jt, 2012; Njoroge jt, 2016). Praeguseks on mõlemal genotüübil märgatavalt palju subklonaalseid variatsioone.
Austraalia
Esimene teade hilisest kartulipõletikust Austraalias pärineb aastast 1907 ja esimene epifütootia, mis on arvatavasti põhjustatud suvekuudel tugevast vihmast, esines aastatel 1909-1911. (Drenth jt, 2002). Üldiselt pole hilispõletikul riigi jaoks olulist majanduslikku tähendust. Hilispõletiku juhuslikud puhangud, mis on põhjustatud kõrge õhuniiskusega ilmastikutingimustest, esinevad mitte rohkem kui üks kord iga 5–7 aasta tagant ja paiknevad peamiselt Tasmaania põhjaosas ja Victoria keskosas. Seoses ülaltooduga praktiliselt puuduvad P. infestansi Austraalia populatsiooni struktuuri uurimisele pühendatud publikatsioonid. Uusim kättesaadav teave pärineb 1998. – 2000. (Drenth jt, 2002). Autorite sõnul oli Victoria populatsioon kloonjoon US-1.3, mis kinnitas kaudselt selle genotüübi rännet Ameerika Ühendriikidest. Tasmaania isendid klassifitseeriti AU-3 kategooriasse, mis erinesid mujal maailmas sel ajal levinud genotüüpidest.
Hilinenud haiguste arengu tunnused Venemaal
Euroopas peetakse kartulite peamiseks inokulaadiks nakatumist, mille põhjustasid haiged seemnemugulad, mullas üle talvitanud oosporoosid, samuti eelmise aasta põldudel ("vabatahtlikud" taimed) kasvatatud taimede tuultest või surmatud hunnikutest kasvatatud taimede tuule poolt põhjustatud zoosporangiad. mugulate hoidmise järjehoidja. Neist visatud mugulate hunnikutel kasvatatud taimi peetakse kõige ohtlikumaks nakkusallikaks. seal võrsunud mugulate arv on sageli märkimisväärne ja zoosporangiat saab neist kanda pikkade vahemaade tagant. Ülejäänud allikad (oosporid, "vabatahtlikud" taimed) pole nii ohtlikud, sest samadel põldudel pole kombeks taimi kasvatada sagedamini kui üks kord 3-4 aasta jooksul. Haigestunud seemnemugulate nakatumine on minimaalne ka hea seemnekvaliteedi kontrollisüsteemi tõttu.
Üldiselt on inokulaadi hulk Euroopa populatsioonides piiratud ja seetõttu on epideemia suurenemine üsna aeglane ja seda saab edukalt kontrollida keemiliste fungitsiidsete preparaatide abil. Peamine ülesanne Euroopa tingimustes on võitlus nakkuse vastu faasis, mil algab zoosporangiate massiline levik mõjutatud taimedest.
Venemaal on olukord radikaalselt erinev. Suurem osa kartuli- ja tomatisaagist kasvatatakse väikestes eraaedades; kaitsemeetmeid ei tehta neile üldse või tehakse fungitsiidseid ravimeetodeid ebapiisavas koguses ja need algavad pärast hilise leotuse ilmumist tippudele. Selle tulemusel toimivad erasektori köögiviljaaiad peamise nakkusallikana, kust tuul viib zoosporangia kommertstaimedele. Seda kinnitavad meie otsesed vaatlused Moskvas, Brjanskis, Kostromas, Rjazani piirkondades: eraaedade taimede kahjustusi täheldatakse juba enne kaubanduslike istanduste fungitsiididega töötlemise algust. Seejärel piirab epideemiat suurtel põldudel fungitsiidpreparaatide kasutamine, samas kui eraaedades on hilispõletik kiiresti arenenud.
Kaubanduslike istanduste ebaõige või "eelarvelise" töötlemise korral ilmuvad põldudele hilispõletiku kolded; hiljem arenevad nad aktiivselt, hõlmates üha suuremaid alasid (Elansky, 2015). Eraaedade nakatumisel on märkimisväärne mõju epideemiatele kaubanduslikel aladel. Kõigis Venemaa kartulikasvatuspiirkondades on eraaedades kartulite pindala mitu korda suurem kui suurtootjate põldude kogupindala. Sellises keskkonnas võib eraviisilisi köögiviljaaedasid vaadelda kui ülemaailmset inokulaadi ressurssi kaubanduslikele põldudele. Proovime tuvastada need omadused, mis on iseloomulikud eraaedade tüvede genotüüpidele.
Toidukartulite, kahtlastelt välismaistelt tootjatelt saadud tomatiseemnete seemneta ja karantiinikontrolli istutamine, kartuli ja tomati pikaajaline kasvatamine samadel aladel, ebaõige fungitsiidne töötlemine või nende täielik puudumine põhjustab erasektoris tõsiseid epifüüte, mille tulemus on tasuta ristumine, hübridiseerumine ja oosporide moodustumine eraaedades. Selle tulemusel täheldatakse patogeeni väga suurt genotüübilist mitmekesisust, kui peaaegu iga tüvi on oma genotüübis ainulaadne (Elansky et al., 2001, 2015). Erineva geneetilise päritoluga seemnekartuli istutamine muudab ebatõenäoliseks teatud sordi ründamiseks spetsialiseerunud kloonjoonte tekkimise. Sellisel juhul valitud tüvesid eristatakse nende mitmekülgsuse poolest mõjutatud sortide suhtes, enamikul neist on peaaegu maksimaalne virulentsusgeenide arv. See erineb suuresti põllumajandusettevõtete suurtele põldudele omasest "kloonjoonte" süsteemist, kus on korralikult paigaldatud hilispõletuse vastane kaitse süsteem. "Kloonjooned" (kui kõiki hilispõletiku patogeeni tüvesid esindab üks või mitu genotüüpi) on kõikjal levinud riikides, kus kartulikasvatust teostavad ainult suured põllumajandusettevõtted: USA, Holland, Taani jne. Inglismaal, Iirimaal, Poolas, kus traditsiooniliselt on levinud ka majapidamiskrundid kartulikasvatusega on eraaedades ka suurem genotüübiline mitmekesisus. 20. sajandi lõpus olid Venemaa Aasia ja Kaug-Ida piirkondades laialdaselt levinud “kloonjooned” (Elansky et al., 2001), mis tuleneb ilmselt samade kartulisortide kasutamisest ainult istutamiseks. Hiljuti hakkas olukord nendes piirkondades muutuma ka populatsioonide genotüübilise mitmekesisuse suurenemise suunas.
Fungitsiidsete preparaatidega intensiivravi puudumisel on teine otsene tagajärg - aedades ei kogune resistentseid tüvesid. Tõepoolest, meie tulemused näitavad, et metalaksüülile vastupidavaid tüvesid leidub eraaedades oluliselt harvemini kui kommertstaimedes.
Eraaedadele omane kartuli- ja tomatiistanduste vaheline lähedus hõlbustab tüvede rännet nende kultuuride vahel, mille tulemusena viimasel kümnendil kartulist eraldatud tüvede hulgas oli varem kirsstomatisortidele (T1) resistentsuse geeni kandvate tüvede osakaal, mis oli varem iseloomulik ainult tomati "tüved. T1 geeniga tüved on enamikul juhtudel nii kartuli kui ka tomati suhtes väga agressiivsed.
Viimastel aastatel hakkas hiline lõhe tomatil paljudel juhtudel ilmnema varem kui kartulil. Tomatiseemned võivad nakatuda mullas olevate oosporidega või tomatiseemnetes esinevate või neist kinni jäävate oosporidega (Rubin et al., 2001). Viimase 15 aasta jooksul on kauplustesse ilmunud suur hulk peamiselt imporditud odavaid pakendatud seemneid, millest enamik väiketootjaid on nende kasutamisele üle läinud. Seemned võivad tuua tüvesid, mille genotüübid on tüüpilised nende kasvupiirkondadele. Tulevikus kaasatakse need genotüübid eraaedade seksuaalprotsessi, mis viib täiesti uute genotüüpide tekkimiseni.
Seega võib väita, et erasektori köögiviljaaiad on ülemaailmne “sulatusahi”, milles geneetilise materjali vahetuse tulemusena töödeldakse olemasolevaid genotüüpe ja tekivad täiesti uued. Veelgi enam, nende valik toimub tingimustes, mis erineb suurte põllumajandusettevõtete kartulite jaoks loodud tingimustest: fungitsiidse pressi puudumine, istandike sordi ühtlus, viiruslike ja bakteriaalsete nakkuste mitmesuguste vormide poolt mõjutatud taimede ülekaal, tomatite ja metsikute öövarjude lähedus, aktiivne ristamine ja oospori moodustumine et oosporid toimiksid järgmisel aastal nakkusallikana.
Kõik see toob kaasa tagaaia populatsioonide väga suure genotüübilise mitmekesisuse. Epifütootilistes tingimustes levib hilispõletik köögiviljaaedades väga kiiresti ja vabaneb tohutul hulgal eoseid, mis lendavad lähedal asuvatele kommertstaimedele. Kuid pärast õige põllumajandustehnoloogia ja keemilise kaitse süsteemi tulekut kaubanduspõldudele pole saabunud eostel praktiliselt mingit võimalust epifütootika käivitamiseks põllul, mis on tingitud fungitsiididele resistentsete ja kultiveeritud sordile spetsialiseerunud kloonjoonte puudumisest.
Teiseks esmase inokulaadi allikaks võivad olla haiged mugulad, mis on püütud kaubanduslikesse seemikutesse. Neid mugulaid kasvatati reeglina hea põllumajandustehnika ja intensiivse keemilise kaitsega põldudel. Mugulaid mõjutanud isolaatide genotüübid on kohandatud nende enda sordi arengule. Need tüved on äriliseks istutamiseks oluliselt ohtlikumad kui eraaedadest pärinevad inokulaadid. Ka meie uuringute tulemused toetavad seda oletust. Korralikult läbi viidud keemilise kaitse ja hea põllumajandustehnoloogiaga suurtelt põldudelt eraldatud populatsioonid ei erine suure genotüübilise mitmekesisuse poolest. Sageli on need mitmed kloonjooned, mis on väga agressiivsed.
Kaubandusliku seemnematerjali tüved võivad siseneda köögiviljaaedade populatsioonidesse ja olla seotud neis toimuvate protsessidega. Köögiviljaaias on nende konkurentsivõime palju madalam kui kaubanduslikul alal ja varsti lakkavad nad kloonjoone kujul olemast, kuid nende geene saab kasutada aiapopulatsioonis.
"Vabatahtlikel" taimedel ja tapetud mugulate hunnikutel koristamise ajal tekkiv nakkus ei ole Venemaa jaoks nii asjakohane, sest Venemaa peamistes kartulikasvatuspiirkondades täheldatakse sügavat talvist mulla külmumist ja mullas talvinud mugulatest pärit taimed arenevad harva. Veelgi enam, nagu meie katsed näitavad, ei ela hilise põletiku patogeen negatiivsel temperatuuril isegi mugulates, mis on oma elujõulisuse säilitanud. Kuivvööndis, kus harrastatakse varajase kartuli kasvatamist, on hiljapõletik kuiva ja kuuma kasvuperioodi tõttu üsna haruldane.
Seega jälgime praegu P. infestansi populatsioonide jagunemist põllu- ja aiapopulatsioonideks. Kuid viimastel aastatel on täheldatud protsesse, mis viivad nende populatsioonide genotüüpide lähenemise ja läbitungimiseni.
Nende seas võib märkida väiketootjate üldise kirjaoskuse kasvu, taskukohaste väikeste seemnekartulipakkide tekkimist, fungitsiidsete preparaatide levikut väikestes pakendites ja elanikkonna hirmu kadumist "keemia" ees.
Olukorrad tekivad siis, kui tänu ühe tarnija jõulisele tegevusele istutatakse terved külad sama sorti seemnemugulatega ja varustatakse väikeste pakenditega samadest pestitsiididest. Võib eeldada, et sama sordi kartuleid leidub läheduses asuvatel kaubanduslikel istandustel.
Teisest küljest propageerivad mõned pestitsiididega kauplevad ettevõtted eelarvelisi keemilise töötlemise skeeme. Sellisel juhul alahinnatakse soovitatud töötluste arvu ja pakutakse odavaimaid fungitsiide ning rõhk ei ole hilise leuke tekkimise ennetamisel kuni latvade niitmiseni, vaid saagi suurendamiseks on mõnel viivitusel epifütotikas. Sellised skeemid on majanduslikult põhjendatud toidukartuli kasvatamisel madalakvaliteetsest seemnematerjalist, kui põhimõtteliselt pole küsimus kõrge saagi saamiseks. Kuid sel juhul aitab erinevalt aiapopulatsioonidest kartuli tasandatud geneetiline taust konkreetsete füsioloogiliste rasside valimisse, mis on selle sordi jaoks väga ohtlikud.
Üldiselt tunduvad kartulitootmise "aia" ja "põllu" meetodite lähenemise tendentsid meile üsna ohtlikud. Nende negatiivsete tagajärgede vältimiseks nii kodu- kui ka kaubandussektoris on vaja kontrollida nii seemnekartuli sortimenti kui ka eraomanikele pakendatud fungitsiidide valikut väikestes pakendites, samuti kartulikaitsesüsteemide jälitamist ja fungitsiidide kasutamist kaubandussektoris.
Erasektori valdkondades on intensiivne areng mitte ainult hilispõletik, vaid ka Alternaria. Enamik eramajapidamiskruntide omanikke ei võta Alternaria eest kaitsmiseks erimeetmeid, eksitades Alternaria arengut tippude loodusliku närbumise või hilispõletiku tekkega. Seetõttu võivad Alternaria tohutult arenenud vastuvõtlikud sordid olla kodumajapidamiste maatükkide jaoks inokulaadi allikaks kaubanduslikel istutustel.
Varieeruvuse mehhanismid
Mutatsiooniprotsess
Kuna mutatsioonide esinemine on juhuslik ja madala sagedusega protsess, sõltub mutatsioonide esinemine mis tahes lookuses selle lookuse mutatsioonide sagedusest ja populatsiooni suurusest. P. infestansi tüvede mutatsioonide sageduse uurimisel määratakse tavaliselt selektiivsetel toitainekeskkondadel pärast keemiliste või füüsikaliste mutageenidega töötlemist kasvanud kolooniate arv. Nagu tabelis 8 esitatud andmetest nähtub, võib sama tüve mutatsioonide sagedus erinevatel lookustel erineda mitu suurusjärku. Metallaksüüliresistentsuse mutatsioonide kõrge esinemissagedus võib olla üks selle suhtes resistentsete tüvede akumuleerumise põhjuseid looduses.
Laboratoorsete katsete põhjal arvutatud spontaansete või indutseeritud mutatsioonide sagedus ei vasta alati looduslikes populatsioonides toimuvatele protsessidele järgmistel põhjustel:
1. Asünkroonsete tuumalõhustumiste korral on võimatu hinnata mutatsioonide sagedust ühe tuumapõlve kohta. Seetõttu annavad enamus katseid teavet ainult otseselt mutatsioonide sageduse kohta, eristamata kahte mutatsioonilist sündmust ja ühte mitoosile järgnevat sündmust.
2. Üheastmelised mutatsioonid vähendavad tavaliselt genoomi tasakaalu, seetõttu väheneb koos uue omaduse omandamisega ka organismi üldine sobivus. Enamikul eksperimentaalselt saadud mutatsioonidest on vähenenud agressiivsus ja neid ei registreerita looduslikes populatsioonides. Seega oli korrelatsioonikordaja P. infestans mutantide fenüülamiidfungitsiidide suhtes resistentsuse määra ja kasvukiiruse vahel kunstlikul söötmel keskmiselt (-0,62) ning kartulilehtede resistentsuse fungitsiidide ja agressiivsuse vahel (-0,65) (Derevyagina et al. , 1993), mis näitab mutantide vähest sobivust. Dimetomorfile resistentsuse mutatsioonidega kaasnes ka elujõulisuse järsk langus (Bagirova et al., 2001).
3. Enamik spontaansetest ja indutseeritud mutatsioonidest on retsessiivsed ega ilmu eksperimentides fenotüüpiliselt, kuid moodustavad looduslike populatsioonide varjatud varieeruvuse reservi. Laborikatsetes eraldatud mutanttüvedel on domineerivad või pool domineerivad mutatsioonid (Kulish ja Dyakov, 1979). Ilmselt seletab tuumadiploidsus ebaõnnestunud katseid saada ultraviolettkiirguse mõjul mutante, mis on varem resistentsete sortide suhtes virulentsed (McKee, 1969). Autori arvutuste kohaselt võivad sellised mutatsioonid esineda sagedusega alla 1: 500000 XNUMX. Retsessiivsete mutatsioonide üleminek homosügootse, fenotüüpselt ekspresseeritud olekuni võib toimuda seksuaalse või mittesugulise rekombinatsiooni tõttu (vt allpool). Kuid ka sel juhul saab mutatsiooni varjata kennootilises (mitmetuumalises) seeneniidistikus metsiktüüpi tuumade domineerivate alleelidega ja fikseerida fenotüüpselt ainult mononukleaarsete zoosporide moodustumise ajal.
Tabel 8. P. infestansi mutatsioonide sagedus kasvu pidurdavateks aineteks nitrosometüüluurea toimel (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Ühendus | Mutatsiooni sagedus |
Oksütetratsükliin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | 7,2 x 10-8 |
Streptomütsiin | 8,3 x10-8 |
Trihotetsiin | 1,8 10 x-8 |
Tsükloheksimiid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorf | 6,3 10 x-7 |
Metalaksiil | 6,9 10 x-6 |
Spontaansete mutatsioonide esinemisel mängib otsustavat rolli ka populatsiooni suurus. Väga suurtes populatsioonides, kus rakkude arv N> 1 / a, kus a on mutatsioonikiirus, lakkab mutatsioon olema juhuslik nähtus (Kvitko, 1974).
Arvutused näitavad, et keskmise kartulipõllu nakatumise korral (35 täppi taime kohta) moodustub päevas 8x1012 eost ühel hektaril (Dyakov ja Suprun, 1984). Ilmselt sisaldavad sellised populatsioonid kõiki mutatsioone, mis on lubatud vahetuse tüübi järgi igas lookuses. Isegi haruldase mutatsiooni, mille esinemissagedus on 10–9, omandab tuhat isendit miljonist, kes elavad ühel hektaril kartulipõldu. Kõrgema sagedusega (näiteks 10–6) esinevate mutatsioonide korral võivad sellises populatsioonis esineda erinevad paarismutatsioonid iga päev (samaaegselt kahes lookuses), s.t. mutatsiooniprotsess asendab rekombinatsiooni.
Ränded
P. infestans'e jaoks on teada kaks peamist rändetüüpi: vahemaade sulgemine (kartulipõllu või naaberpõldude piires), levitades zoosporangiat õhuvoolude või vihmapihustite abil, ja pikad vahemaad - mugulate istutamise või veetud tomativiljade abil. Esimene meetod näeb ette haiguse fookuse laienemist, teine - uute fookuste loomine primaarsetest kaugematesse kohtadesse.
Tomatimugulate ja puuviljadega nakatumise levik ei aita mitte ainult kaasa haiguse tekkele uutes kohtades, vaid on ka peamine geneetilise mitmekesisuse allikas populatsioonides. Moskva piirkonnas kasvatatakse kartuleid, mis on toodud Venemaa erinevatest piirkondadest ja Lääne-Euroopast. Tomati vilju tuuakse Venemaa lõunapoolsetest piirkondadest (Astrahani piirkond, Krasnodari piirkond, Põhja-Kaukaasia). Tomatiseemneid, mis võivad olla ka nakkusallikad (Rubin et al., 2001), imporditakse ka Venemaa lõunapoolsetest piirkondadest, Hiinast, Euroopa riikidest ja teistest riikidest.
E. Mayri (1974) arvutuste kohaselt ületavad mutatsioonide põhjustatud geneetilised muutused kohalikus populatsioonis harva 10–5 lookuse kohta, samas kui avatud populatsioonides on geenide vastuvoolust tingitud vahetus vähemalt 10–3–10–4.
Nakatunud mugulate ränne põhjustab P. infestans'i Euroopasse sisenemist, levides kõikidesse maailma piirkondadesse, kus kasvatatakse kartuleid; need põhjustasid kõige tõsisemaid rahvastikumuutusi. Hiline kartulipõletik ilmus Vene impeeriumi territooriumil peaaegu samaaegselt selle ilmumisega Lääne-Euroopas.
Kuna Balti riikides täheldati seda haigust esmakordselt aastatel 1846-1847 ja alles järgnevatel aastatel levis see Valgevenes ja Venemaa loodepiirkondades, on selle Lääne-Euroopa päritolu ilmne. Esimene hilispõletiku allikas vanas maailmas pole nii ilmne. Fry jt (Fry jt, 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin jt, 1994) välja töötatud hüpotees viitab sellele, et parasiit tuli kõigepealt Mehhikost Põhja-Ameerikasse, kus see levis põllukultuuridele, ja seejärel transporditi Lääne-Euroopasse. (joonis 7).
Korduva triivi ("pudelikaela" topeltmõju) tagajärjel jõudsid Euroopasse üksikud kloonid, mille järglased põhjustasid pandeemia kogu Vana Maailma territooriumil, kus kasvatatakse kartulit. Selle hüpoteesi tõendina toovad autorid esiteks välja ainult ühe tüüpi paaritumise (A1) üldlevinud esinemise ja teiseks uuritud erinevate piirkondade tüvede genotüüpide homogeensuse (kõik need põhinevad molekulaarsetel markeritel, sealhulgas 2 isosüümi lookusel, DNA sõrmejälgede mustritel ja mitokondriaalse DNA struktuur on identne ja vastab USA-s kirjeldatud USA-1 kloonile). Kuid mõned andmed tekitavad kahtlusi vähemalt mõne hüpoteesi sätete osas. 40ndatel esimesel epifütootilisel perioodil nakatunud herbaariumikartuli proovidest eraldatud P. infestans mitokondriaalse DNA analüüs näitas, et need erinevad mitokondriaalse DNA struktuuri poolest kloonist US-1, mis seetõttu oli vähemalt mitte ainus nakkusallikas Euroopas (Ristaino et al, 2001).
Hilispõletiku olukord halvenes taas XX sajandi 80ndatel. Toimunud on järgmised muudatused:
1) Elanikkonna keskmine agressiivsus on suurenenud, mis on viinud eelkõige hilispõletiku kõige kahjulikuma vormi - leherootsude ja varte kahjustuse laialdase levikuni.
2) Kartulite hilinenud aeg oli nihkes - juuli lõpust juuli alguseni ja isegi juuni lõpuni.
3) Varem Vanas maailmas puudunud A2-tüüpi paaritumistüüp on muutunud üldlevinud.
Muudatustele eelnes kaks sündmust: uue fungitsiidi metalaksüüli massiline kasutamine (Schwinn ja Staub, 1980) ning Mehhiko esilekerkimine kartuli maailmaeksportijana (Niederhauser, 1993). Sellega seoses esitati populatsiooni muutuste kaks põhjust: paaritumistüübi muutmine metalaksüüli mõjul (Ko, 1994) ja Mehhikost nakatunud mugulatega uute tüvede massiline sissetoomine (Fry ja Goodwin, 1995). Kuigi metalaksüüli toimel toimuvad paaritumistüüpide vastastikused muutused saadi mitte ainult Ko poolt, vaid ka Moskva Riikliku Ülikooli laboris tehtud töödega (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), on eelistatav teine hüpotees. Koos teist tüüpi paaritumisega ilmnesid tõsised muutused vene P. infestansi tüvede genotüüpides, sealhulgas neutraalsetes geenides (isosüümi ja RFLP lookused), samuti mitokondriaalse DNA struktuuris. Nende muutuste kompleksi ei saa seletada metalaksüüli toimega, pigem tehti Mehhikost massiliselt uusi tüvesid, mis agressiivsemalt (Kato et al., 1997) tõrjusid vanad tüved (US-1) ümber, muutudes populatsioonides domineerivaks. Euroopa populatsioonide koosseisu muutus toimus väga lühikese aja jooksul - 1980. aastast 1985. aastani (Fry et al., 1992). Endise NSV Liidu territooriumil leiti 1985. aastal Eestist pärit kogudest “uusi tüvesid” ehk varem kui Poolas ja Saksamaal (Goodwin et al., 1994). Viimati eraldati Venemaal asuv "vana tüvi US-1" nakatunud tomatist Moskva oblastis 1993. aastal (Dolgova jt, 1997). Ka Prantsusmaal leiti tomatite istandustest “vanu” tüvesid kuni 90ndate alguseni, st pärast seda, kui need olid kartulitel juba ammu kadunud (Leberton ja Andrivon, 1998). P. infestansi tüvede muutused mõjutasid paljusid tunnuseid, sealhulgas neid, millel oli suur praktiline tähtsus, ja suurendasid hilispõletiku kahjulikkust.
Seksuaalne rekombinatsioon
Selleks, et seksuaalne rekombinatsioon aitaks kaasa varieeruvusele, on esiteks vaja populatsioonis kahte tüüpi paaritumist 1: 1 lähedases vahekorras ja teiseks populatsiooni esialgse varieeruvuse olemasolu.
Paaritumistüüpide suhe on erinevates populatsioonides ja isegi erinevatel aastatel ühes populatsioonis väga erinev (tabel 9,10, 90). Selliste drastiliste muutuste põhjused paaritumistüüpide sageduses populatsioonides (nagu näiteks Venemaal või Iisraelis eelmise sajandi 2002ndate alguses) pole teada, kuid arvatakse, et see on tingitud konkurentsivõimelisemate kloonide kasutuselevõtust (Cohen, XNUMX).
Mõned kaudsed andmed näitavad seksuaalse protsessi kulgu teatud aastatel ja teatud piirkondades:
1) Moskva piirkonna populatsioonide uuringud näitasid, et 13 populatsioonis, kus A2 paaritusliigi osakaal oli alla 10%, oli kolme isosüümi lookuse jaoks arvutatud kogu geneetiline mitmekesisus 0,08 ja 14 populatsioonis, kus A2 osakaal ületas 30%, geneetiline mitmekesisus oli kaks korda suurem (0,15) (Elansky et al., 1999). Seega, mida suurem on seksuaalvahekorra tõenäosus, seda suurem on elanikkonna geneetiline mitmekesisus.
2) Seost populatsioonide paaritumistüüpide suhte ja oospori moodustumise intensiivsuse vahel täheldati Iisraelis (Cohen et al., 1997) ja Hollandis
(Flier jt, 2004). Meie uuringud on näidanud, et populatsioonides, kus A2-tüüpi paaritumisega isolaadid moodustasid 62, 17, 9 ja 6%, leiti oosporasid vastavalt 78, 50, 30 ja 15% analüüsitud kartulilehtedest (2 või enama laiguga).
Kahe või enama täppiga proovid sisaldasid oosporasid palju tõenäolisemalt kui ühe laiguga proovid (vastavalt 2 ja 1% proovidest) (Apryshko et al., 32).
Oosporasid esines palju sagedamini kartulitaime keskmise ja alumise kihi lehtedes (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Mõnes piirkonnas on avastatud ainulaadsed genotüübid, mille esinemist seostatakse seksuaalse rekombinatsiooniga. Nii on Poolas 1989. ja Prantsusmaal 1990 tüved glükoos-6-
fosfaat-isomeraas (GPI 90/90). Kuna varem kohtus 10 aasta jooksul ainult 90/100 heterosügootidega, on homosügootsus omistatud seksuaalsele rekombinatsioonile (Sujkowski et al., 1994). Colombias (USA) on tavalised isolaadid, mis ühendavad A2 GPI 100/110-ga ja A1 GPI 100/100-ga, kuid 1994. aasta hooaja lõpus (16. august ja 9. september) on rekombinantse genotüübiga tüved (A1 GPI 100/110) ja A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Mõnes Poola (Sujkowski et al., 1994) ja Põhja-Kaukaasia (Amatkhanova et al., 2004) populatsioonis vastab sõrmejälgede DNA lookuste ja allosüümvalgu lookuste jaotus Hardy-Weinbergi jaotusele, mis näitab
suur osa seksuaalse rekombinatsiooni panusest populatsiooni varieeruvusse. Teistes Venemaa piirkondades ei leitud vastavust Hardy-Weinbergi jaotusele populatsioonides, kuid demonstreeriti sideme tasakaalustamatust, mis osutab klonaalse paljunemise ülekaalule (Elansky et al., 1999).
5) Erinevate paaritumistüüpidega (A1 ja A2) tüvede geneetiline mitmekesisus (GST) oli väiksem kui erinevate populatsioonide vahel (Sujkowski et al., 1994), mis viitab kaudselt seksuaalsetele ristumistele.
Samal ajal ei saa seksuaalse rekombinatsiooni osakaal rahvastiku mitmekesisuses olla väga suur. See panus arvutati Moskva piirkonna elanikkonna kohta (Elansky jt, 1999). Lewontini (1979) arvutuste kohaselt muutub "rekombinatsioon, mis võib toota uusi variante kahest lookusest sagedusega, mis ei ületa nende heterosügootsuste korrutist, efektiivseks ainult siis, kui mõlema alleeli heterosügootsuse väärtused on juba kõrged".
Kui Moskva piirkonnale tüüpiline kahe tüüpi paaritamine on võrdne 4: 1, on rekombinatsiooni sagedus 0,25. Tõenäosus, et ristunud tüved on heterosügootsed kahel kolmest uuritud isosügootsest lookusest uuritud populatsioonides, oli 0,01 (2 tüve 177-st). Seetõttu ei tohiks rekombinatsiooni tagajärjel topeltheterosügootide esinemise tõenäosus ületada nende korrutist korrutamise tõenäosusega (0,25x0,02x0,02) = 10-4, s.t. seksuaalsed rekombinandid tavaliselt ei kuulu uuritud tüveproovi. Need arvutused tehti Moskva piirkonna populatsioonide kohta, mida iseloomustas suhteliselt suur varieeruvus. Sellistes monomorfsetes populatsioonides nagu Siberi populatsioonid ei saa seksuaalne protsess, isegi kui see toimub üksikisikute populatsioonides, nende geneetilist mitmekesisust mõjutada.
Lisaks on P. infestansile iseloomulik kromosoomide sagedane hälbimine meioosis, mis põhjustab aneuploidiat (Carter et al., 1999). Sellised rikkumised vähendavad hübriidide viljakust.
Paraseksuaalne rekombinatsioon, mitootilise geeni muundamine
Erinevate kasvu inhibiitorite suhtes resistentsuse mutatsioonidega P. infestansi tüvede liitmise katsetes leiti mõlema inhibiitori suhtes resistentsete misolaatide tekkimine (Shattock ja Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Kahe kasvuinhibiitori suhtes resistentsed tüved tekkisid seeneniidistiku heterokarüotiseerimise tagajärjel ja sel juhul lagunesid nad mononukleaarsete zoosporide paljunemise käigus (Judelson, Ge Yang, 1998) või ei lagunenud monosoorsetes järglastes, kuna neil olid tetraploidsed (kuna algsed isolaadid on diploidsed tuumad) , 1979). Heterosügootsed diploidid eraldusid haploidiseerimise, kromosoomi mittesidumise ja mitootilise ristumise tõttu väga madalal sagedusel (Poedinok et al., 1982). Nende protsesside sagedust saaks suurendada heterosügootsetele diploididele avaldatava teatava mõju abil (näiteks idanevate eoste ultraviolettkiirgus).
Kuigi topeltresistentsusega vegetatiivsete hübriidide moodustumine toimub mitte ainult in vitro, vaid ka mutantide seguga nakatunud kartulimugulates (Kulish et al., 1978), on parasexual rekombinatsiooni rolli populatsioonides uute genotüüpide tekkimisel üsna keeruline hinnata. Haploidiseerumisest, kromosoomide mittesiduvusest ja mitootilisest ristumisest ilma eriefektideta tekkivate segregantide moodustumise sagedus on tühine (vähem kui 10-3).
Heterosügootsete tüvede homosügootsete segregantide tekkimine võib põhineda nii mitootilisel ristumisel kui ka mitootilise geeni muundamisel, mis P. sojae puhul toimub sagedusega 3 x 10-2 kuni 5 x 10-5 lookuse kohta, sõltuvalt tüvest (Chamnanpunt et al. , 2001).
Kuigi heterokarüoonide ja heterosügootsete diploidide esinemissagedus osutus ootamatult suureks (ulatudes kümnetesse protsenti), toimub see protsess ainult siis, kui samast tüvest saadud mutantsed kultuurid on splaissitud. Erinevate loodusest eraldatud tüvede kasutamisel heterokarüotiseerumist ei toimu (või toimub väga madala sagedusega) vegetatiivse kokkusobimatuse olemasolu tõttu (Poedinok ja Dyakov, 1981; Anikina jt, 1997b; Cherepennikova-Anikina jt, 2002). Järelikult saab paraseksuaalse rekombinatsiooni rolli taandada ainult heterosügootsetes tuumades toimuvaks intraklonaalseks rekombinatsiooniks ja üksikute geenide üleminekuks homosügootse seisundisse ilma seksuaalse protsessita. See protsess võib olla epidemioloogiliselt oluline tüvedes, millel on retsessiivsed või pool domineerivad fungitsiidiresistentsuse mutatsioonid. Selle üleminek homosügootsesse olekusse parasexual protsessi tõttu suurendab mutatsiooni kandja resistentsust (Dolgova, Dyakov, 1986).
Geenide introgressioon
Heterotaalsed liigid Phytophthora on võimelised ristuma hübriidsete oosporide moodustumisega (vt Vorob'eva ja Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Kahe Phytophthora liigi looduslik hübriid oli nii agressiivne, et tappis Suurbritannias tuhandeid leppe (Brasier et al., 1999). P. infestans võib esineda teiste perekonna liikidega (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum jt) tavalistel peremeestaimedel ja mullas, kuid kirjanduses on vähe teavet liikidevaheliste hübriidide võimalikkuse kohta. Laboratoorsetes tingimustes saadi P. infestans ja P. Mirabilis hübriidid (Goodwin ja Fry, 1994).
Tabel 9. A2 paarumistüübiga P. infestansi tüvede osakaal maailma erinevates riikides ajavahemikul 1990–2000 (avatud kirjandusallikate ja saitide www.euroblight.net, www.eucablight.org andmetel)
Riik | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Valgevene | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgia | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ecuador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Eesti | 8 (12) | ||||||||||
Англия | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Soome | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Prantsusmaa | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Ungari | 72 (32) | ||||||||||
Iirimaa | 4 (145) | ||||||||||
Põhjas. Iirimaa | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Holland | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Norra | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peruu | 0 (34, 1984–86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Poola | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландия | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Rootsi | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Hiina | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbia | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Uruguay | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mehhiko (Toluca) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
Tabel 10. A2-tüüpi paaritumisega P. infestansi tüvede osakaal maailma erinevates riikides ajavahemikul 2000–2011
Riik | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austria | 65 (83) | ||||||||||
Valgevene | 42 (78) | ||||||||||
Belgia | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Šveits | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Saksamaa | 95 (53) | ||||||||||
Taani | 48 (52) | ||||||||||
Ecuador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Eesti | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англия | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Soome | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Prantsusmaa | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Ungari | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Põhjas. Iirimaa | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Holland | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Norra | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peruu | 0 (36) | ||||||||||
Poola | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландия | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Rootsi | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakkia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brasiilia | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Hiina | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Populatsioonide genotüüpse koostise dünaamika
Muutused P. infestansi populatsioonide genotüüpses koostises võivad ilmneda uute kloonide migratsiooni teistest piirkondadest, põllumajandustavade (sordivahetus, fungitsiidide kasutamine) ja ilmastikutingimuste mõjul. Välised mõjud mõjutavad klooni elutsükli eri etappides erinevalt; seetõttu toimuvad populatsioonides igal aastal tsüklilised muutused selektsiooni alla kuuluvate geenide sagedustes, mis on tingitud geenide triivi ja valiku domineeriva rolli muutumisest.
Sordi mõju
Uued vertikaalse resistentsuse geenidega sordid (R-geenid) on võimas selektiivne tegur, mis valib P. infestansi populatsioonides komplementaarsete virulentsusgeenidega kloonid. Kartulisordi mittespetsiifilise resistentsuse puudumisel, mis pärsib patogeenide populatsiooni kasvu, toimub populatsioonis domineerivate kloonide vahetamise protsess väga kiiresti. Niisiis, pärast R3 resistentsuse geeni omava sordi Domodedovsky levikut Moskva piirkonnas suurenes selle sordi virulentsete kloonide sagedus ühe aastaga 0,2-lt 0,82-le (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Kuid virulentsusgeenide (patotüüpide) sageduste muutus populatsioonides toimub mitte ainult kultiveeritud kartulisortide mõjul. Näiteks domineerisid Valgevenes kuni 1977. aastani virulentsusgeenidega 1 ja 4 kloonid, mille põhjustas resistentsusgeenidega R1 ja R4 kartulisortide kasvatamine (Dorozhkin, Belskaya, 1979). XX sajandi 70-ndate aastate lõpus ilmusid kloonid siiski erinevate virulentsusgeenide ja nende kombinatsioonidega ning komplementaarseid resistentsusgeene ei kasutatud kartulikasvatuses (ekstra virulentsusgeenid) kunagi (Ivanyuk et al., 2002). Selliste kloonide ilmumise põhjus on ilmselt Mehhikost pärit kartulimugulatega nakkusohtliku materjali ränne Euroopasse. Kodus arenesid need kloonid mitte ainult kultiveeritud kartulitel, vaid ka metsikutel liikidel, millel olid mitmesugused resistentsusgeenid; seetõttu oli nendes tingimustes ellujäämiseks vajalik paljude virulentsusgeenide kombinatsioon genoomis.
Mis puutub mittespetsiifilise resistentsusega sortidesse, siis viivitades patogeeni paljunemiskiiruse vähendamisega, lükkavad nad edasi selle populatsioonide arengut, mis, nagu juba mainitud, on arvu funktsioon. Kuna agressiivsus on polügeenne, kogunevad kloonid, mis sisaldavad suuremat hulka "agressiivsuse" geene, seda kiiremini, seda suurem on populatsiooni suurus. Seetõttu ei ole väga agressiivsed rassid kohandatud mittespetsiifilise resistentsusega kultiveeritud sortidega, vaid vastupidi, neid avastatakse pigem parasiitide eoste akumuleeruvate väga vastuvõtlike sortide istandustes.
Nii leiti Venemaal kõige agressiivsemad P. Infestansi populatsioonid iga-aastaste epifüütide tsoonides (Sahhalini, Leningradi ja Brjanski oblastite populatsioonid). Nende populatsioonide agressiivsus osutus Mehhiko omast kõrgemaks (Filippov et al., 2004).
Lisaks moodustub resistentsete sortide lehtedes vähem oosporoone kui vastuvõtlikes (Hanson ja Shattock, 1998), see tähendab, et sordi mittespetsiifiline resistentsus vähendab ka parasiidi rekombinatsioonivõimeid ja alternatiivsete talvitamisviiside võimalust.
Fungitsiidide mõju
Fungitsiidid ei vähenda mitte ainult fütopatogeensete seente arvu, s.t. mõjutavad nende populatsioonide kvantitatiivseid omadusi, kuid võivad muuta ka üksikute genotüüpide sagedusi, s.t. mõjutada populatsioonide kvalitatiivset koosseisu. Fungitsiidide toimel muutuvate populatsioonide kõige olulisemate näitajate hulgas on järgmised: resistentsuse muutused fungitsiidide suhtes, muutused agressiivsuses ja virulentsuses ning muutused reproduktiivsüsteemis.
Fungitsiidide mõju populatsioonide resistentsusele ja agressiivsusele
Selle mõju määra määrab ennekõike kasutatava fungitsiidi tüüp, mille võib tinglikult jagada polüsaatideks, oligosiitideks ja monosiitideks.
Esimene hõlmab enamikku kontaktfungitsiide. Resistentsust neile (kui see on üldse võimalik) kontrollib suur hulk väga nõrgalt ekspressiivseid geene. Need omadused määravad populatsiooni resistentsuse nähtavate muutuste puudumise pärast fungitsiididega töötlemist (kuigi mõnes katses saavutati resistentsuse mõningane suurenemine). Pärast kontaktfungitsiididega pihustamist säilinud seenpopulatsioon koosneb kahest tüvirühmast:
1) Tüved, mis on säilinud ravimita ravimata taimede piirkondades. Kuna fungitsiidiga ei olnud kontakti, ei muutu nende tüvede agressiivsus ja resistentsus.
2) Fungitsiidiga kokkupuutuvad tüved, mille kontsentratsioon kokkupuutepunktides oli alla surmava. Nagu eespool mainitud, ei muutu ka selle elanikkonna osa vastupanuvõime fungitsiidi osalise kahjuliku mõju tõttu isegi subletaalses kontsentratsioonis seenraku ainevahetusele, üldisele vormile ja selle parasiitkomponendile, agressiivsusele, vähenemisele (Derevyagina ja Dyakov, 1990).
Seega on isegi osa populatsioonist, kes ei ole surnud, puutunud kokku fungitsiidiga, nõrga agressiivsusega ega saa olla epifütootikumide allikas. Seetõttu on kaitsemeetmete edukuse tingimus hoolikas ravi, mis vähendab fungitsiidiga kokkupuutumata elanikkonna osakaalu. Vastupanuvõimet oligosiidifungitsiididele kontrollivad mitmed aditiivsed geenid.
Iga geeni mutatsioon põhjustab resistentsuse mõningast suurenemist ja üldine resistentsuse aste on tingitud selliste mutatsioonide lisamisest. Seetõttu toimub resistentsuse suurenemine järk-järgult. Resistentsuse järkjärgulise suurenemise näiteks on mutatsioonid vastupanuvõimes fungitsiidile dimetomorfile, mida kasutatakse laialdaselt kartuli kaitsmiseks hilise leostumise eest. Dimetomorfne resistentsus on polügeenne ja aditiivne. Üheastmeline mutatsioon suurendab veidi resistentsust.
Iga järgmine mutatsioon vähendab sihtmärgi suurust ja sellest tulenevalt ka järgnevate mutatsioonide sagedust (Bagirova et al., 2001). Populatsiooni keskmise resistentsuse suurenemine pärast mitmekordset töötlemist oligositi fungitsiidiga toimub järk-järgult ja järk-järgult. Selle protsessi kiiruse määravad vähemalt kolm tegurit: resistentsusgeenide mutatsioonide sagedus, resistentsuskoefitsient (resistentse tüve surmava doosi suhe tundliku suhtes) ja resistentsusgeenide mutatsioonide mõju sobivusele.
Iga järgneva mutatsiooni esinemissagedus on väiksem kui eelmine, seetõttu on protsessil summutav olemus (Bagirova et al., 2001). Kui aga populatsioonis toimuvad rekombinatsiooniprotsessid (seksuaalsed või parasexuaalsed), siis on võimalik hübriidses tüves kombineerida erinevaid vanemate mutatsioone ja protsessi kiirendada. Seetõttu omandavad panmix-populatsioonid resistentsuse kiiremini kui agaamilised, ja viimases populatsioonid, millel pole vegetatiivseid kokkusobimatusbarjääre, on kiiremad kui selliste barjääridega jagatud populatsioonid. Sellega seoses kiirendab tüvede olemasolu populatsioonides, mis erinevad paaritumistüüpides, resistentsuse omandamise protsessi oligosiitfungitsiidide suhtes.
Teine ja kolmas tegur ei aita kaasa dimetomorf-resistentsete tüvede kiirele kuhjumisele populatsioonides. Iga järgnev mutatsioon kahekordistab resistentsust ligikaudu, mis on ebaoluline ja vähendab samal ajal nii kasvukiirust tehiskeskkonnas kui ka agressiivsust (Bagirova et al., 2001; Stem, Kirk, 2004). Võib-olla seetõttu pole looduslike P. infestansi tüvede hulgas praktiliselt ühtegi resistentset tüve, isegi neid, mis on kogutud dimetomorfiga töödeldud kartulite istandustest.
Oligosiidifungitsiidiga ravitav populatsioon koosneb samuti kahest tüvirühmast: need, mis ei ole fungitsiidiga kokku puutunud ega ole seetõttu muutnud esialgseid omadusi (kui selle rühma hulgas leitakse resistentseid tüvesid, ei kogune nad tundlike tüvede suurema agressiivsuse ja konkurentsivõime tõttu), ja tüved, mis puutuvad kokku fungitsiidi subletaalse kontsentratsiooniga. Just viimaste seas on võimalik resistentsete tüvede akumuleerumine, sest siin on neil tundlike omadega võrreldes eeliseid.
Seetõttu pole oligosiidifungitsiidide kasutamisel oluline mitte niivõrd põhjalik ravi, kuivõrd ravimi kõrge kontsentratsioon, mitu korda suurem kui surmav annus, sest astmelise mutageneesi korral on muteerunud tüvede esialgne resistentsus madal.
Lõpuks, monosiidifungitsiidide suhtes resistentsuse mutatsioonid on väga ekspressiivsed, see tähendab, et üks mutatsioon võib näidata kõrge resistentsuse taset kuni tundlikkuse täieliku kadumiseni. Seetõttu toimub populatsioonide resistentsuse suurenemine väga kiiresti.
Selliste fungitsiidide näiteks on fenüülamiidid, sealhulgas kõige tavalisem fungitsiid, metalaksüül. Resistentsuse mutatsioonid sellele toimuvad suure sagedusega ja mutantide resistentsusaste on väga kõrge - see ületab tundlikku tüve tuhande või enama kordajaga (Derevyagina et al., 1993). Ehkki resistentsete mutantide kasvukiirus ja agressiivsus süsteemse fungitsiidi suhtes vastuvõtlike tüvede surma taustal väheneb, kasvab resistentsete populatsioonide arv kiiresti ja paralleelselt suureneb ka nende agressiivsus. Seetõttu ei saa resistentsete tüvede agressiivsus pärast mitu aastat kestnud fungitsiidi kasutamist võrdsustada tundlike omaduste agressiivsust, vaid ka ületada selle (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Mõju seksuaalsele rekombinatsioonile
Kuna A2-tüüpi paaritumistüüpide sagedane esinemine P. infestansi populatsioonides langes kokku metalaksüüli intensiivse kasutamisega hilispõletiku vastu, siis eeldati, et metalaksüül kutsub esile paaritustüübi konversiooni. P. parasiticas tõestati eksperimentaalselt sellist muundumist kloronebi ja metalaksüüli toimel (Ko, 1994). Ühekordne läbipääs madala metalaksüülikontsentratsiooniga söötmel põhjustas homotalliliste isolaatide tekkimise A1-tüüpi paaritumisega metalaksüüli suhtes tundlikus P. infestans'i tüves (Savenkova ja Cherepnikova-Anikina, 2002). Järgnevate käikude korral kõrgema metalaksüüli kontsentratsiooniga söötmel ei tuvastatud ühtegi A2 paaritustüüpi isolaati, kuid enamik isolaate, ristudes A2 isolaatidega, moodustasid oosporide asemel koledad seeneniidistikud ja olid steriilsed. A2-tüüpi paaritumiskindla tüve läbipääsud metalaksüüli kõrge kontsentratsiooniga söötmel võimaldasid meil tuvastada kolme tüüpi paaritumistüüpi: 1) täielik steriilsus ristamisel A1- ja A2-isolaatidega; 2) homotallism (oosporide moodustumine monokultuuris); 3) A2 paaritusliigi teisendamine A1-ks. Seega võib metalaksüül põhjustada muutusi paaritumise tüüpides P. infestansi populatsioonides ja sellest tulenevalt ka seksuaalse rekombinatsiooni esinemist neis.
Mõju vegetatiivsele rekombinatsioonile
Mõned antibiootikumiresistentsuse geenid suurendasid hüfaalse heterokarüotiseerimise ja tuuma diploidiseerimise sagedust (Poedinok ja Dyakov, 1981). Nagu varem märgitud, toimub hüüfide heterokarüotoosimine P. infestansi erinevate tüvede liitmisel väga harva vegetatiivse kokkusobimatuse nähtuse tõttu selles seenes. Mõne antibiootikumi suhtes resistentsuse geenidel võivad siiski olla kõrvaltoimed, mis väljenduvad vegetatiivse kokkusobimatuse ületamises. Seda omadust omas 1S-1 mutantne streptomütsiini resistentsuse geen. Selliste mutantide esinemine fütoftoora välipopulatsioonides võib suurendada tüvede vahelist geenivoogu ja kiirendada kogu populatsiooni kohanemist uute sortide või fungitsiididega.
Teatud fungitsiidid ja antibiootikumid võivad mõjutada mitootilise rekombinatsiooni sagedust, mis võib muuta ka populatsioonide genotüübi sagedusi. Laialdaselt kasutatav fungitsiid benomüül seondub beeta-tubuliiniga - valguga, millest ehitatakse tsütoskeleti mikrotuubulid, ja seeläbi häiritakse kromosoomide eraldumise protsesse mitoosi anafaasis, suurendades mitootilise rekombinatsiooni sagedust (Hastie, 1970).
Fungitsiidil para-fluorofenüülalaniinil, mida kasutatakse Hollandi haiguse raviks jalakates, on sama omadus. Parafluorofenüülalaniin suurendas rekombinatsiooni sagedust heterosügootsetes diploidides P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Tsüklilised muutused populatsioonide genotüüpses koostises P. infestansi elutsüklis
Parasvöötme P. infestans'i klassikaline arengutsükkel koosneb 4 faasist.
1) Lühikeste põlvkondadega populatsiooni eksponentsiaalse kasvu faas (polütsükliline faas). See etapp algab tavaliselt juulis ja kestab 1,5-2 kuud.
2) Populatsiooni kasvu peatamise etapp mõjutamata koe osakaalu järsu vähenemise või ebasoodsate ilmastikutingimuste tõttu. See faas põllumajandusettevõtetes, kus tehakse varajast koristamiseelset lehtede eemaldamist, langeb aastatsüklist välja.
3) mugulate talvitamise etapp, millega kaasneb populatsiooni suuruse oluline vähenemine mugulate juhusliku nakatumise, nendes nakkuse aeglase arengu, mugulate uuesti nakatumise puudumise, kahjustatud mugulate mädanemise ja hävitamise tõttu normaalsetes hoiutingimustes.
4) Mullas ja seemikute aeglase arengu faas (monotsükliline faas), mille jooksul võib põlvkonna kestus ulatuda kuuni või kauem (mai lõpus - juuli alguses). Tavaliselt on sel ajal haigestunud lehti raske isegi erivaatluste abil tuvastada.
Eksponentsiaalse populatsiooni kasvu faas (polütsükliline faas)
Arvukad vaatlused (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) näitasid, et epifütooti alguses domineerivad madala virulentsusega ja kergelt agressiivsed kloonid, mis asendatakse hiljem virulentsemate ja agressiivsematega. populatsiooni agressiivsuse kasvutempo on suurem, seda vähem resistentne peremeestaime sort.
Populatsiooni suurenedes suureneb nii kaubanduslike sortide (R1-R4) kui ka valikuliselt neutraalsete (R5-R11) sisse viidud valikuliselt oluliste geenide kontsentratsioon. Nii kasvas 1993. aastal Moskva lähedal asuvas populatsioonis keskmine virulentsus juuli lõpust augusti keskpaigani 8,2-lt 9,4-le ja kõige rohkem täheldati selektiivselt neutraalset virulentsusgeeni R5 (31 kuni 86% virulentsetest kloonidest) (Smirnov, 1996 ).
Populatsiooni kasvu kiiruse vähenemisega kaasneb populatsiooni parasiitide aktiivsuse vähenemine. Seetõttu on depressiivsetel aastatel nii võistluste koguarv kui ka väga virulentsete võistluste osakaal väiksem kui epifütootilistel (Borisenok, 1969). Kui epifütootiliste kõrguste korral muutuvad ilmastikutingimused hilispõletiku jaoks ebasoodsaks ja kartulite nakatumine väheneb, väheneb ka väga virulentsete ja agressiivsete kloonide kontsentratsioon (Rybakova et al., 1987).
Populatsiooni virulentsust ja agressiivsust mõjutavate geenide sageduse suurenemine võib olla tingitud virulentsemate ja agressiivsemate kloonide valikust segapopulatsioonis. Valiku demonstreerimiseks töötati välja neutraalsete mutatsioonide analüüsimeetod, mida kasutati edukalt pärmi (Adams et al., 1985) ja Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995) kemostaatide populatsioonides.
Blasticidiin S suhtes resistentsete mutantide sagedus P. infestans'i välipopulatsioonis vähenes paralleelselt populatsiooni agressiivsuse kasvuga, mis viitab domineerivate kloonide muutumisele populatsiooni kasvu ajal (Rybakova et al., 1987).
Talvine faas mugulates
Kartulimugulate talvitamise ajal väheneb P. infestansi tüvede virulentsus ja agressiivsus ning virulentsuse vähenemine toimub aeglasemalt kui agressiivsus (Rybakova ja Dyakov, 1990). Ilmselt populatsiooni suurele kiirele kasvule (r-selektsioon) soodsates tingimustes on kasulikud "ekstra" virulentsusgeenid ja kõrge agressiivsus, seetõttu kaasneb epifütootikumide arenguga kõige virulentsemate ja agressiivsemate kloonide valik. Keskkonna küllastumise tingimustes, kus olulist rolli mängib mitte paljunemiskiirus, vaid eksisteerimine püsimises ebasoodsates tingimustes (K-selektsioon), vähendavad virulentsuse ja agressiivsuse "ekstra" geenid sobivust ning nende geenidega kloonid surevad esimesena välja, nii et keskmine agressiivsus ja elanikkonna virulents langeb.
Taimkatte faas mullas
See etapp on elutsükli kõige salapärasem (Andrivon, 1995). Selle olemasolu postuleeritakse puhtalt spekulatiivselt - teabe puudumise kohta selle kohta, mis juhtub patogeeniga pika aja jooksul (mõnikord rohkem kui kuu) - alates kartuli seemikute tekkimisest kuni haiguse esimeste laikude ilmumiseni neile. Vaatluste ja katsete põhjal rekonstrueeriti seene käitumine sellel eluperioodil (Hirst ja Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Seene sporulatsioon võib tekkida mullas nakatunud mugulatel. Saadud eosed idanevad hüüfidega, mis võivad mullas pikka aega taimestuda. Esmased (moodustunud mugulatel) ja sekundaarsed (mullas oleval seeneniidistikul) eosed tõusevad kapillaarvoolude abil küll mullapinnale, kuid omandavad kartuli nakatamise võime alles siis, kui selle alumised lehed laskuvad ja puutuvad kokku mullapinnaga. Sellised lehed (nimelt leitakse haiguse esimesed laigud) ei moodustu kohe, vaid pärast kartuli pealmiste pikaajalist kasvu ja arengut.
Seega võib saprotroofne taimkatte faas esineda ka P. infestansi elutsüklis. Kui elutsükli parasiidifaasis on agressiivsus kõige olulisem sobivuse komponent, siis saprotroofses faasis on valiku eesmärk parasiitiliste omaduste vähendamine, nagu on eksperimentaalselt näidatud mõne fütopatogeense seene puhul (vt Carson, 1993). Seetõttu tuleks tsükli selles faasis agressiivsed omadused kõige intensiivsemalt kaotada. Kuid seni pole otseseid katseid ülaltoodud eelduste kinnitamiseks läbi viidud.
Hooajalised muutused ei mõjuta mitte ainult P. infestansi patogeenseid omadusi, vaid ka resistentsust fungitsiidide suhtes, mis kasvab polütsüklilises faasis (epifüütide ajal) ja väheneb talvel ladustamisel (Derevyagina et al., 1991; Kadish ja Cohen, 1992). Eriti intensiivset metallaksüüliresistentsuse langust täheldati kahjustatud mugulate istutamise ja haiguse esimeste laikude ilmnemise vahel põllul.
Liigisisese spetsialiseerumine ja selle areng
P. infestans põhjustab epideemiaid kahes majanduslikult olulises kultuuris - kartulis ja tomatis. Epifüütimine kartulitel algas varsti pärast seene sisenemist uutele aladele. Tomati lüüasaamist märgiti ka varsti pärast nakkuse ilmnemist kartulitel, kuid tomati epifüütimist täheldati alles sada aastat hiljem - XNUMX. sajandi keskel. Siin kirjutavad Hallegli ja Niederhauser tomatite lüüasaamisest USA-s
(1962): „Umbes 100 aastat pärast 1845. aasta tõsist epifütotiat ei üritatud resistentsete tomatisortide saamiseks vähe või peaaegu mitte ühtegi katset. Ehkki tomatid registreeriti hilist põletust esmakordselt juba 1848. aastal, ei saanud see taim selle kasvatajate tõsise tähelepanu objektiks enne haiguse tugevat puhangut 1946. aastal. Venemaa territooriumil registreeriti hiline tomatipõletik 60. sajandil. „Pikka aega ei pööranud teadlased sellele haigusele tähelepanu, kuna see ei põhjustanud olulist majanduslikku kahju. Kuid 70. ja 1979. aastatel. XX sajandi hilispõletiku epifüüte tomati peal täheldatakse ka Nõukogude Liidus, peamiselt Alam-Volga piirkonnas, Ukrainas, Põhja-Kaukaasias, Moldovas ... ”(Balashova, XNUMX).
Sellest ajast alates on hilispõletik tomatipõletik muutunud iga-aastaseks, see on levinud kogu tööstus- ja kodukasvatuse territooriumil ning põhjustab sellele kultuurile tohutut majanduslikku kahju. Mis juhtus? Miks parasiidi esmakordne ilmnemine kartulitel ja selle põllukultuuri epifütootiline kahjustus tekkisid peaaegu üheaegselt ja miks kulus epifütooti ilmumine tomatile sajandiks? Need erinevused toetavad pigem Mehhiko kui Lõuna-Ameerika nakkusallikat. Kui liik Phytophthora infestans arenes välja perekonna Solanum Mehhiko mugulat sisaldavate liikide parasiidina, siis on mõistetav, miks Mehhiko liikidega samasse perekonna sektsiooni kuuluvad kultiveeritud kartulid olid nii tugevalt mõjutatud, kuid parasiidiga samaaegse evolutsiooni puudumise tõttu, millel ei tekkinud spetsiifilise ja mittespetsiifilise resistentsuse mehhanisme.
Tomat kuulub perekonna erinevasse sektsiooni, selle vahetamise tüübil on mugulaliikidest märkimisväärseid erinevusi, seetõttu oli vaatamata sellele, et tomat ei kuulu P. infestansi toiduspetsialiseerumisele, polnud tema kahjustuste intensiivsus piisav tõsiste majanduslike kahjude jaoks.
Epifüütide tekkimine tomatil on tingitud parasiidi tõsistest geneetilistest muutustest, mis parasiidi ajal suurendasid tema vormi (patogeensust). Usume, et tomati parasiitimiseks spetsialiseerunud uus vorm on M. Gallegly kirjeldatud T1 rass, mis mõjutab kirsstomatite (Red Cherry, Ottawa) sorte, mis on resistentsed kartulitel laialt levinud T0 rassi suhtes (Gallegly, 1952). Ilmselt mutatsioon (või mutatsioonide jada), mis muutis T0 rassi T1 rassi ja viis tomatite alistamiseks väga kohandatud kloonide tekkeni. Nagu sageli juhtub, kaasnes ühe peremeesorganismi patogeensuse suurenemisega selle vähenemine teisele, see tähendab tekkis esialgne, veel täielik liigisisene spetsialiseerumine - kartulile (rass T0) ja tomatile (rass T1).
Mis on selle oletuse tõendid?
- Esinemine kartulitel ja tomatitel. Tomatilehtedel on ülekaalus T1 rass, kartulilehtedel aga harva. S.F.Bagirova ja T.A sõnul Oreshonkova (avaldamata) Moskva oblastis aastatel 1991-1992 oli T1 rassi esinemine kartuliistandustes 0% ja tomatiistandustes - 100%; aastatel 1993-1995 - vastavalt 33% ja 90%; 2001. aastal - 0% ja 67%. Sarnased andmed saadi Iisraelist (Cohen, 2002). Kartulimugulate nakatamise katsed T1 rassi isolaatide ning isolaatide T0 ja T1 seguga näitasid, et T1 rassi isolaadid on mugulates halvasti säilinud ja asendatud T0 rassi isolaatidega (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) T1 jooksu dünaamika tomatiistandustes. Tomatilehtede esmase nakatamise teostavad T0 rassi isolaadid, mis nakkuse analüüsimisel domineerivad esimestel lehtedel tekkinud laigudel. See kinnitab parasiitide rände üldtunnustatud skeemi: põhilise kartulite nakatumise massi tekitab T0 rass, kuid väike osa kartulites säilinud T1 kloonidest, olles kord tomatil, tõrjuvad T0 rassi ja kogunevad epifütootilise perioodi lõpupoole. Samuti on võimalik, et T1 võistlusega on olemas alternatiivne tomatilehtede nakatumise allikas, mis ei ole nii võimas kui kartulimugulad ja lehed, kuid on konstantne. Seetõttu on sellel allikal nõrk mõju tomati nakatava populatsiooni geneetilisele struktuurile, kuid see määrab hiljem T1 rassi kuhjumise (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agressiivsus kartulite ja tomatite suhtes. Tomati- ja kartulilehtede kunstlik nakatamine rassi T0 ja T1 isolaatidega näitas, et esimesed on kartuli suhtes agressiivsemad kui tomatid ja teised tomati kui kartuli suhtes agressiivsemad. Need erinevused avalduvad mitte-"oma" rassi isolaatide nihkumises segapopulatsioonist kasvuhoones lehtede läbimise ajal (D'yakov et al., 1975) ja maatükkidel (Leberton et al., 1999); minimaalse nakkuskoormuse, latentsusaja, nakkuslike laikude suuruse ja eostoodangu erinevused (Rybakova, 1988; Dyakov jt, 1994; Legard jt, 1995; Forbes jt, 1997; Oyarzun jt, 1998; Leberton jt. al., 1999; Vega-Sanchez jt, 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna jt, 2004).
T1 rassi isolaatide agressiivsus resistentsusgeenidest puuduvate tomatisortide suhtes on nii suur, et need isolaadid eostavad lehti kui toitainekeskkonda nakatunud koe nekrotiseerimata (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) kartulite ja tomatite virulentsus. T1 rass mõjutab Ph1 resistentsusgeeniga kirsstomatite sorte, samas kui T0 rass ei ole võimeline neid sorte nakatama, s.t. on kitsama virulentsusega. Eristajate suhtes
Kartuli R-geenid on pöördvõrdelised, s.t. tomatilehtedest eraldatud tüved on vähem virulentsed kui “kartuli” tüved (tabel 11).
5) neutraalsed markerid. Kartulitel ja tomatitel parasiteerivate P. infestansi populatsioonide neutraalsete markerite analüüs annab tunnistust ka mitmesuunalisest liigisisestest valikutest. P. infestans'i Brasiilia populatsioonides kuulusid tomatilehe isolaadid kloonjoonesse US-1 ja kartulilehtedelt BR-1 (Suassuna et al., 2004). Floridas (USA) hakkasid alates 1994. aastast kartulites domineerima kloon US-90 (esinemissagedus oli üle 8%) ning tomatis kloonid US-11 ja US-17 ning viimase isolaadid on tomati suhtes agressiivsemad kui kartuli (Weingartner) , Tombolato, 2004). Olulised erinevused kartuli- ja tomatisolaatide genotüübi sagedustes (DNA sõrmejäljed) tuvastati 1200 P. infestans'i tüvele, mis koguti Ameerika Ühendriikides aastatel 1989–1995 (Deahl et al., 1995).
AFLP meetodi kasutamine võimaldas eraldada 74 kartuli- ja tomatilehtedelt aastatel 1996-1997 kogutud tüve. Prantsusmaal ja Šveitsis, 7 rühmas. Kartuli- ja tomatitüved ei erinenud selgelt, kuid "kartuli" tüved olid geneetiliselt mitmekesisemad kui "tomat". Esimesed leiti kõigist seitsmest klastrist ja teised vaid neljast, mis viitab viimase spetsiifilisemale genoomile (Knapova ja Gisi, 2002).
6) isolatsiooni mehhanismid. Kui kahe peremeestaimeliigi parasiidi populatsioonid arenevad spetsialiseerumise kitsenemise suunas oma “peremeesorganismi” suunas, siis tekivad mitmesugused pre- ja postmeiootilised mehhanismid, mis takistavad populatsioonidevahelist geneetilist vahetust (Dyakov ja Lekomtseva, 1984).
Mitmes uuringus on uuritud vanemate tüvede allika mõju hübridiseerimise efektiivsusele. Ecuadoris perekonna Solanum erinevatest liikidest eraldatud tüvede ristamisel (Oliva et al., 2002) leiti, et metsikutest Solanaceae (kloonjoon EC-2) A2-ga paaritumisega tüvedest ristuvad kõige halvemini tomatitüved (liin EC -3) ja ristati kõige tõhusamalt kartulitüvega (EC-1).
Leiti, et kõik hübriidid ei ole patogeensed. Autorid usuvad, et hübriidide madal hübridiseerumise protsent ja patogeensuse vähenemine on tingitud populatsioonide reproduktiivse isolatsiooni postmeiootilistest mehhanismidest.
Bagirova jt (1998) katsetes ristati suur hulk kartuli- ja tomatitüvesid T0 ja T1 rassi omadustega. Kõige viljakamad olid tomatist eraldatud T1xT1 tüvede ristamised (mikroskoobi vaateväljas 36 oosporo, 44% oosori idanemisest), kõige vähem tõhusad olid erinevatelt peremeestelt eraldatud T0xT1 rasside ristamised (väike arv arenenud ja idanenud oospoore, suur hulk abortivaid ja vähearenenud oosoore) ... Kartulitest eraldatud T0 rassi isolaatide vaheliste ristamiste efektiivsus oli keskmine. Kuna T0 rassi tüvede põhiosa mõjutab kartuleid, on tal usaldusväärne talvitumise allikas - kartulimugulad, mille tõttu on oosporide kui nakkusüksuste talvitamise tähtsus kartulipopulatsioonide jaoks madal. Kohandatud “tomativorm” on võimeline talvitama tomatil oosporade kujul (vt allpool) ja säilitab seetõttu seksuaalprotsessi suurema tootlikkuse. Suure viljakuse tõttu omandab T1 tomatis iseseisva esmase nakatumise potentsiaali. Knapova jt (Knapova jt, 2002) saadud tulemusi saab tõlgendada samamoodi. Kartulitest eraldatud tüvede ristandid tomatitüvedega andsid kõige rohkem oosporasid - 13,8 ruutmeetri kohta. keskkond (levik 5–19) ja oosporade idanemise vaheprotsent (6,3 levikuga 0–24). Tomatist eraldatud tüvede ristamisel saadi kõige vähem oosporasid (7,6 levikuga 4–12), mille idanevuse protsent oli kõige suurem (10,8). Kartulitest eraldatud tüvede ristamisel saadi vahepealne arv oosporoore (suure andmevajutusega 8,6 - 0–30) ja madalaim oosporide idanemisprotsent (2,7). Seega on kartulitüved vähem viljakad kui tomatil, kuid populatsioonidevahelised ristamised ei andnud halvemaid tulemusi kui populatsioonisiseseid. Võimalik, et erinevused Bagirova jt ülaltoodud andmetega. on seletatavad asjaoluga, et Venemaa teadlased töötasid 90. sajandi 90ndate alguses isoleeritud tüvedega ja Šveitsi teadlased - XNUMXndate lõpus isoleeritud tüvedega.
Madal viljakus võib olla tingitud heteroploidsetest tüvedest. Kui Mehhiko populatsioonides, kus suguline protsess ja esmane nakatumine oospori järglastega on regulaarne, on enamik uuritud P. Infestans'i tüvedest diploidsed, siis Vana Maailma riikides on täheldatud plopüüsi polümorfismi (di-, tri- ja tetraploidsed tüved, samuti heteroparoidsete tuumadega heterokarüootsed tüved). ja erinevat tüüpi paaritumisega tüved, s.t. vastastikku viljakad, erinevad tuuma ploidia poolest (Therrien jt, 1989, 1990; Whittaker jt, 1992; Ritch, Daggett, 1995). Madala viljakuse põhjuseks võib olla tuumade mitmekesisus anteriidiates ja oogoonias.
Mis puutub anafüloomide ajal toimuvatesse hüüfide tuumavahetustesse, siis seda takistab vegetatiivne kokkusobimatus, mis lagundab aseksuaalsed populatsioonid paljudeks geneetiliselt isoleeritud kloonideks (Poedinok ja Dyakov, 1987; Gorbunova jt, 1989; Anikina jt, 1997b).
7) populatsioonide lähenemine. Ülaltoodud andmed näitavad, et hübriidimine on võimalik kartuli ja tomati P. infestans tüvede vahel. Võimalik on ka erinevate peremeeste vastastikune uuesti nakatamine, ehkki vähenenud agressiivsusega.
1993. aastal külgnevate kartuli- ja tomatipõldude isolaatide populatsioonimarkerite uuring näitas, et umbes veerand tomatilehtedest eraldatud isolaatidest viidi üle naabruses asuvalt kartulipõllult (Dolgova et al., 1997). Teoreetiliselt võib eeldada, et populatsioonide lahknemine kahe peremehe vahel suureneb ja viib spetsiifiliste liigisiseste vormide (nt kartul ja tomat tomat) tekkimiseni, eriti kuna oosporid võivad püsida taimejäätmetes (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) ja tomatiseemned (Rubin et al., 2001). Järelikult on tomatitel praegu kevadise taastumise allikas, mis ei sõltu kartulimugulatest.
Kõik juhtus aga teisiti. Oosporitega talvitamine võimaldas parasiidil vältida oma elutsükli kõige kitsamat etappi - taimestiku monotsüklilist staadiumi mullas, mille käigus parasiitilised omadused vähenevad, mis suvel polütsüklilises faasis järk-järgult taastuvad.
Tabel 11. Virulentsusgeenide esinemissagedus kartuli diferentseerivate sortide korral P. infestansi tüvedes
Riik | Aasta | Virulentsusgeenide keskmine arv tüvedes | Autor | |
kartulist | tomatist | |||
Prantsusmaa | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton jt, 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Prantsusmaa, Šveits | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
USA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin jt, 1995 |
USA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance jt, 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ecuador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun jt, 1998 |
Iisrael | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Venemaa, Mosk. piirkonnas | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Venemaa, erinevad piirkonnad | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja ja teised. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Esmastel zoosporangiatel ja oosporasid idandavatel zoosporidel on kõrge parasiitide aktiivsus, eriti kui oosporid moodustati vastupidise paaritumisega tüve feromoonide mõjul partenogeneetiliselt. Seetõttu on oosporidega nakatunud seemnetest kasvatatud tomati seemikute nakkav materjal nii tomati kui ka kartuli jaoks väga patogeenne.
Need muutused viisid teise rahvastiku ümberkorraldamiseni, mida väljendasid epidemioloogilisest vaatepunktist järgmised olulised muudatused:
- Nakatunud tomati seemikud on muutunud kartulite esmase nakatumise oluliseks allikaks (Filippov, Ivanyuk, isiklikud sõnumid).
- Epifüütimist kartulitel hakati jälgima juba juunis, umbes kuu varem kui tavaliselt.
- Kartuliistandustes suurenes T1 rassi protsent, mida varem leiti seal tähtsusetult (Ulanova et al., 2003).
- Tomatilehtedest eraldatud tüved ei erinenud enam kartulitüvedest virulentsuses virulentsusgeenide kartulidiferentatoritel ja hakkasid agressiivsuses ületama “kartuli” tüvesid mitte ainult tomatil, vaid ka kartulil (Lavrova et al., 2003; Ulanova et al. , 2003).
Seega toimus lahknemise asemel populatsioonide ühtlustumine, ühe populatsiooni tekkimine kahel peremeestaimel, millel oli kõrge virulentsus ja agressiivsus mõlema liigi suhtes.
Järeldus
Niisiis, hoolimata enam kui 150 aastat kestnud intensiivsest P. infestans'i uurimisest, on bioloogias, sealhulgas kultiveeritud üksiktaimede kõige olulisemate haiguste selle põhjustaja populatsioonibioloogias palju teadmata. Ei ole selge, kuidas mõjutab elutsükli üksikute etappide läbimine populatsioonide struktuuri, millised on agressiivsuse ja virulentsuse kanaliseeritud varieeruvuse geneetilised mehhanismid, milline on looduslike populatsioonide reproduktiivse ja klonaalse paljunemissüsteemi suhe, kuidas on pärilik vegetatiivne kokkusobimatus, milline on kartulite ja tomatite roll nende kultuuride esmasel nakatamisel milline on nende mõju parasiidi populatsiooni struktuurile. Siiani pole lahendatud selliseid olulisi praktilisi küsimusi nagu parasiidi agressiivsuse muutmise geneetilised mehhanismid või mittespetsiifilise kartuliresistentsuse erosioon. Kartulite hilispõletiku uurimise süvenemise ja laienemisega esitab parasiit teadlastele uusi väljakutseid. Katsevõimekuse paranemine, geenide ja valkudega manipuleerimise uute metoodiliste lähenemisviiside ilmnemine võimaldab aga loota esitatud küsimuste edukale lahendusele.
Artikkel ilmus ajakirjas "Potato Protection" (nr 3, 2017)