SÖÖMA. Tšudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Hiljuti on tõestatud, et ascomycete seen Ilyonectria crassa on võimeline nakatama kartulimugulaid. See töö on esimene, mis analüüsib kartulitest eraldatud I. crassa tüve bioloogilisi omadusi ja vastupidavust mõnele fungitsiidile. “Kartuli” tüve liigispetsiifiliste piirkondade järjestused langesid kokku varasemaga, mis saadi nartsissist, ženšennist, haavast ja pöögist, liiliasibulatest ja tulbisortidest eraldatud seente puhul. Ilmselt võivad paljud mets- ja aiataimed olla I. crassa varuks. Uuritud tüvi nakatas tomati- ja kartuliviile, kuid ei nakatanud tervet tomativilja ja puutumata kartulimugulat. See näitab, et I. crassa on haavaparasiit. Fludioksoniili, difenokonasooli ja asoksüstrobiini suhtes resistentsuse hindamine toitainekeskkonnas näitas nende ravimite suurt efektiivsust.
EC50 indikaator (fungitsiidi kontsentratsioon, mis aeglustub koloonia radiaalse kasvu 2-kordse kiirusega võrreldes fungitsiidivaba kontrolliga) oli 0.4; Vastavalt 7.4 ja 4 mg / l. Kartulimugulate fütopatoloogilisel hindamisel ja taimekaitsemeetmete väljatöötamisel tuleks arvesse võtta I. crassa põhjustatud haiguse tekkimise võimalust.
Fütopatogeensete mikroorganismide areng põhjustab kartuli kasvatamise ja ladustamise kõigil etappidel suuri kadusid. Kaitsemeetmete kavandamisel võetakse reeglina arvesse tuntud patogeene, näiteks perekondade Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora jt liike. Kuid viimastel aastatel on üha rohkem teateid uute fütopatogeensete mikroorganismide ilmnemise kohta kartulil. Nende bioloogiat on vähe uuritud, kartulitel kasutatavate fungitsiidide efektiivsus nende suhtes pole teada, diagnostikameetodeid pole välja töötatud. Massilise arenguga on nad võimelised kartulisaagile olulist kahju tekitama. Üks neist mikroorganismidest on ascomycete seen Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, mille autorid avastasid esmakordselt kartulimugulatelt (Chudinova et al., 2019).
Selles töös esitatakse kartulimugulatest eraldatud I. crassa tüve analüüsi tulemused. Uuriti I. crassa kolooniate ja mütseelstruktuuride morfoloogiat, liigispetsiifiliste DNA piirkondade nukleotiidjärjestusi, virulentsust kartuli ja tomati suhtes ning resistentsust mõnede populaarsete fungitsiidide suhtes.
materjalid ja meetodid
Kasutasime 18. aastal Kostroma piirkonnas kasvatatud nakatunud kartulimugulast eraldatud I. crassa 2KSuPT2018 tüve. Mugulat mõjutas kuivmädanik, mille õõnsus oli kaetud helepruuni seeneniidistikuga. Steriilse dissekteerimisnõela abil viidi seeneniidistik agari söötmega Petri tassi (õlle virre 10%, agar 1.5%, penitsilliin 1000 U / ml). Plaate inkubeeriti pimedas temperatuuril 24 ° C.
Eoste ja eoseorganite pildistamiseks, suuruse ja morfoloogia hindamiseks kasutati Leica DM2500 valgusmikroskoobi ICC50 HD digitaalkaameraga ja Leica M80 binokulaarset mikroskoobi koos IC80HD digikaameraga (Leica Microsystems, Saksamaa).
DNA eraldamiseks kasvatati seenemütseel vedelas hernesöötmes, seejärel külmutati vedelas lämmastikus, homogeniseeriti, inkubeeriti CTAB puhvris, puhastati kloroformiga ja pesti kaks korda 2% alkoholiga.
DNA ekstraheerimismeetodit on artiklis Kutuzova et al. (2017).
Liigi määramiseks molekulaarsete meetoditega ja teiste tuntud I. crassa tüvedega võrdlemiseks viidi PCR läbi praimeritega, mis võimaldasid liigispetsiifiliste DNA piirkondade amplifikatsiooni: ITS1-5,8S-ITS2 (praimerid ITS5 / ITS4, White et al., 1990), geenipiirkonnad b -tubuliin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) ja translatsiooni pikenemistegur la (tef1α) (praimerid EF1-1F / EF728-1R, Carbone ja Kohn, 986). Soovitud pikkusega amplikoonid ekstraheeriti geelilt, kasutades komplekti Evrogen CleanUp. Võimendatud piirkonnad sekveneeriti, kasutades BigDye® Terminator v1999 tsüklijärjestuse komplekti (Applied Biosystems, CA, USA) automatiseeritud järjestusseadmel Applied Biosystems 3.1 xl (Applied Biosystems, CA, USA). Saadud nukleotiidjärjestusi kasutati vaste otsimiseks USA riikliku biotehnoloogia teabe keskuse (NCBI) GenBanki andmebaasist. Fülogeneetiline analüüs viidi läbi programmi MEGA 3730 abil (Tamura et al., 6).
Virulentsuse määramine viidi läbi suureviljalise tomati (sort Dubrava) ja kartulimugulate (sordi Gala) tervetel rohelistel viljadel. Lisaks kasutasime kahjustatud puuviljade ja mugulate kahjustuste simuleerimiseks samade puuviljade ja mugulate viilusid. Mugulaviilud pandi niisketesse kambritesse, mis olid Petri tassid, mille põhjas oli märg filterpaber. Paberile pandi slaid, millele omakorda pandi mugulaviilud või puuviljad. Terved mugulad ja puuviljad pandi ka konteineritesse, mille põhjas oli märg filterpaber. Viilu keskele (või mugula või puuvilja puutumata pinnale) pandi pärast 5-päevast virde-agaril kasvatamist agaritükk (5 × 5 mm) koos seenhaigustega.
Seenetüvede resistentsuse hindamine fungitsiidide suhtes viidi läbi laboritingimustes agari toitainekeskkonnas. Uurisime vastuvõtlikkust fungitsiidsetele ravimitele Maxim, KS (toimeaine fludioksoniil, 25 g / l), Quadris, KS (asoksüstrobiin 250 g / l), Scor, EC (difenokonasool 250 g / l) (riiklik kataloog ..., 2020). Hindamine viidi läbi Petri tassidel virre-agari söötmel, lisades uuritud ravimeid toimeaine kontsentratsioonides 0.1; üks; 1 ppm (mg / l) (fludioksoniili ja difenokonasooli puhul), 10; kümme; 1 ppm (asoksüstrobiini puhul) ja fungitsiidita söötmes (kontroll). Fungitsiid lisati sulatatud keskkonda, mis oli jahutatud temperatuurini 10 ° C, seejärel valati sööde Petri tassidesse. Seente seeneniidistikuga agarplokk asetati Petri tassi keskele ja kultiveeriti pimedas temperatuuril 100 ° C. Pärast 60-päevast inkubeerimist mõõdeti kolooniate läbimõõdud kahes vastastikku risti; iga koloonia mõõtmistulemused keskmistati. Katsed viidi läbi kolmes eksemplaris. Analüüside tulemuste põhjal arvutati EC24, mis võrdus fungitsiidi kontsentratsiooniga, mis vähendas koloonia radiaalse kasvu kiirust poole võrra fungitsiidse kontrolli suhtes.
Tulemused ja arutlus
Virre-agariga petritassidel moodustas seene valge flokulentse seeneniidistikuga kolooniad. Seeneniidialune söötme värvus muutus punakaspruuniks. Sööde kuivamisel moodustas seen väikestes sporodohhiates üksikutel ja agregeeritud konidiofooridel kahte tüüpi eoseid. Makrokoniidiad on piklikud, silindrikujulised, ühe kuni kolme vaheseinaga, keskmise pikkusega 27.2 um, väärtuste vahemikuga 23.2 kuni 32.2 um, laiusega kuni 4.9 um (joonis 1). Mikrokoniidiate keskmine pikkus on 14.3 um, väärtuste vahemik on 10.3 kuni 18.1 um, laius on kuni 4.0 um. Kõik makro- ja mikromorfoloogilised märgid sobivad liigi Ilyonectria crassa variatsioonivahemikku (Cabral et al., 2012).
Liigispetsiifiliste DNA piirkondade (ITS, b-tubuliin, TEF 1α) järjestused langesid täielikult kokku varem uuritud I. crassa tüvede järjestustega (Chudinova et al., 2019, tabel 1). I. crassa levimuse uurimiseks teistes piirkondades ja mõjutatud kultuuride spektri analüüsimiseks analüüsiti analoogseid DNA järjestusi GenBanki andmebaasis (tabel 1). Kattuvus oli 86 kuni 100%. Kõigi kolme “kartuli” I. crassa tüve DNA piirkonna järjestused olid identsed Hollandis liiliasibula ja nartsissi juurtest ning Kanadas ženšennijuurest eraldatud tüvede järjestustega. Teisi I. crassa tüvesid koos kolme analüüsitud sarnase järjestusega avatud andmebaasidest ei õnnestunud leida. Sadestunud ITS- ja b-tubuliinijärjestuste analüüs näitas siiski I. crassa esinemist tulbilehtedel Suurbritannias. Sarnase ITS-järjestusega seened tuvastati Kanadas haabjuurte ja Itaalias pöökjuurte, Saudi Araabias kartulimugulate mükobiota analüüsimisel (tabel 1). Selle uuringu tulemused näitavad, et I. crassa on levinud globaalselt ja on võimeline nakatama erinevaid taimeliike.
Tomatite ja kartuliviilude patogeensuse määramisel 5. päeval ulatus kahjustuse läbimõõt 1.5 cm-ni.Uuritud tüvi ei nakatanud tervet tomativilja ja tervet kartulimugulat. Tomati peal aga mõjutasid tupplehed. Kartulimugula viilul tekkinud seeneniidistiku saastumise võimaluse välistamiseks eraldati seeneisolaat puhtasse kultuuri. See oli täiesti identne vanemate tüvega. Ilmselt on I. crassa haavaparasiit.
Seemnemugulate fungitsiididega töötlemine enne istutamist vähendab taimedel haiguste teket kasvuperioodil. Tõhusate fungitsiidide valimiseks on oluline hinnata, millised neist on I. сrassa vastu tõhusad. Töö uuris fungitsiidide laialt levinud toimeaineid - fludioksoniili, asoksüstrobiini, difenokonasooli. Fludioksoniil on lisatud mitmesse segusse, mida kasutatakse seemnete ja seemnemugulate töötlemiseks enne istutamist. Fludioksoniili (Maxim) kasutatakse ka seemnemugulate töötlemiseks enne ladustamist. Difenokonasool ja asoksüstrobiin sisalduvad ka paljudes seemnematerjali töötlemiseks kasutatavates preparaatides, samuti vegetatiivsete taimede töötlemiseks mõeldud preparaatides (riiklik kataloog ..., 2020).
I. crassa kasvukiirust uuriti keskmise toimeaine kontsentratsiooniga söötmel (joonis 2): fludioksoniil (EC50 = 0.4 ppm), asoksüstrobiin (EC50 = 4 ppm) ja difenokonasool (EC50 = 7.4 ppm) (tabel 2). Neid preparaate võib pidada I. crassa vastu väga tõhusaks, kuna nende EC50 on oluliselt madalam preparaadi soovitatavast kontsentratsioonist mugulate töötlemiseks kasutatavas töövedelikus. Riikliku kataloogi ... (2020) kohaselt on fludioksoniili kontsentratsioon kartulimugulate töötlemiseks mõeldud vedelikus 500 kuni 1000 ppm, asoksüstrobiin (vao põhja töötlemiseks mõeldud vedelikus) - 3750–9375 ppm, difenokonasool (vegetatiivsete taimede töötlemise vedelikus) - 187.5– 625 ppm.
Tabel 1. Genbanki andmebaasis saadaval olevate tüve 18KSuPT2 ja Ilyonectria crassa liigispetsiifiliste järjestuste järjestuste sarnasus
Tüve | Peremeestaim, eritumiskoht | GenBanki deponeeritud järjekorranumbrid, protsent sarnasustest | Link | ||
ITS | β-tubuliin | TEF 1α | |||
17KSPT1 ja 18KSuPT2 | Kartulimugul, Kostroma piirkond | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova jt, 2019, see töö |
CBS 158/31 | Nartsissijuured, Holland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral jt, 2012 |
CBS 139/30 | Liiliasibul, Holland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ženšenni juur, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulbileht, Suurbritannia | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Haabjuured, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield jt, 2020 |
ER1937 | Pöök, Itaalia | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Otsene esitamine |
KAUF19 | Kartulimugul, Saudi Araabia | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ei ole hoiustatud
Tabel 2. Ilyonectria crassa resistentsus fungitsiidide suhtes
(toimeaine) | EC50, ppm | ||||
3 päeva | 5 päeva | 7 päeva | |||
Kontrollida | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (foksüstrobiin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksoniil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EÜ (difenokonasool) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Meie töös eraldati I. crassa tüved kartulimugulatest Kostroma ja Moskva (Chudinova et al., 2019) piirkonnas. Analüüsides Saudi Araabia kartulimugulate mükobioota (Gashgari ja Gherbawy, 2013), selgus suur osa I. crassaga identsete ITS-järjestustega seenetüvedest. Ilmselt pole I. crassa kartulitel nii haruldane kui võib tunduda. Meie katsed näitasid, et seen võib nakatada kahjustatud tomativilju. Kirjandusest on teada, et I. crassa on võimeline arenema mullas saprotroofselt (Moll et al., 2016), samuti võib see mõjutada mitmesuguseid taimi, isegi taksonoomiliselt kaugeid taimi, nagu nartsissid, liiliad, ženšenn, haab ja pöök (tabel 1). üks). Ilmselt võivad paljud mets- ja aiataimed olla I. crassa varuks. Eelnev näitab, et kaitsemeetmete väljatöötamisel tuleb arvestada võimalusega selle seenega kartulimuguleid mõjutada. Fludioksoniili, asoksüstrobiini ja difenokonasooli sisaldavate laiaulatuslike preparaatidega kartulimugulate töötlemisel on I. crassa vastu kõrge fungitsiidne efektiivsus.
Seda tööd toetas Venemaa Alusuuringute Fond (toetuse nr 20-016-00139).
Artikkel ilmus ajakirjas "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)